Moléculas de unión con base en fibronectina mejorada y usos de las mismas.

Una molécula de unión con base en Fn3 biespecífica que comprende un dominio de Fn3,

en donde por lo menosun aminoácido en una o más de las regiones de bucle inferiores AB, CD o EF o terminal C del dominio de Fn3 sealtera en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO:1 para crear una secuenciade unión sin Fn3 que se une a un primer objetivo, y en donde por lo menos un aminoácido en una o más de lasregiones de bucle superiores BC, DE o FG del dominio de Fn3 se altera en comparación con el dominio de Fn3 tiponatural que comprende la SEQ ID NO:1 para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un segundoobjetivo.

Moléculas de unión con base en fibronectina mejorada y usos de las mismas Información de prioridad

Esta solicitud reivindica la prioridad para la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense serie No. 61/050, 142, presentada el 2 de mayo, 2008, cuyos contenidos se incorporan aquí mediante referencia en su totalidad.

Información relacionada Los contenidos de cualesquier patentes, solicitudes de patente, y referencias citadas a lo largo de esta especificación se incorporan aquí mediante referencia en su totalidad.

Antecedentes de la invención Las moléculas capaces de unión específica a un epítopo objetivo deseado son de enorme importancia como herramientas terapéuticas y de diagnóstico médico. Un ejemplo bien conocido de esta clase de moléculas es el anticuerpo monoclonal. Se pueden seleccionar los anticuerpos que se unen específicamente y con alta afinidad con casi cualquier epítopo estructural. Como resultado, los anticuerpos se utilizan de forma rutinaria como herramientas de investigación y como medicamentos aprobados por la FDA de tal manera que el mercado mundial para anticuerpos monoclonales terapéuticos o de diagnóstico tiene actualmente un valor de aproximadamente 30 mil millones de dólares.

Sin embargo, los anticuerpos monoclonales tienen un número de inconvenientes. Por ejemplo, los anticuerpos clásicos con moléculas grandes y complejas. Tienen una estructura heterotetramérica que comprende dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas conectadas juntas por enlaces inter e intra de disulfuro. Esta complejidad estructural impide la fácil expresión de anticuerpos en los sistemas procarióticos simples y requiere que se produzcan anticuerpos en forma más elaborada (y costosa) en sistemas celulares de mamíferos. El tamaño grande de los anticuerpos también limita su efectividad terapéutica debido a que a menudo son incapaces de penetrar de forma eficiente ciertos espacios del tejido. Los anticuerpos terapéuticos, en razón a que poseen una región Fc, de forma ocasional desencadenan la función celular efectora no deseada y/o cascada de coagulación. Adicionalmente, la generación de anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos a menudo involucra procedimientos difíciles y complejos (Véase por ejemplo, Josefina et al., (1997) , Nature Biotechnology, 15: 159-163; y Wu et al. (2007) Nature Biotechnology, 25: 1290-1297) .

De acuerdo con lo anterior subsiste una necesidad en la técnica de moléculas de unión alternas capaces de unión específica a un objetivo deseado con alta afinidad y especificidad. También subsiste una necesidad de un método simple para generar moléculas de unión biespecíficas o multiespecíficas.

Resumen de la Invención La presente invención proporciona moléculas de unión con base en fibronectina tipo III (Fn-3) que se unen específicamente a un antígeno objetivo y, así, se pueden utilizar en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. La invención se basa en el descubrimiento de moléculas de unión con base en Fn3 biespecíficas novedosas en las que una molécula de Fn3 única puede unir una o más moléculas objetivo al utilizar los bucles de Fn3 superior e inferior. La descripción también proporciona un método simple, eficiente para generar moléculas de unión con base en Fn3 biespecíficas y multiespecíficas.

La descripción se refiere a moléculas de unión con base en Fn3 monoespecíficas que utilizan los bucles AB, CD, EF inferiores o terminal C para unir uno o más objetivos (“moléculas de unión con base en Fn3 monoespecíficas inferiores”) por ejemplo, albúmina de suero humana (HSA) , lizozima. En una realización de la invención, estas moléculas de unión con base en Fn3 monoespecíficas inferiores se pueden ligar (por ejemplo, en forma similar a perla) para formar moléculas de unión con base en Fn3 multiespecíficas que se unen de forma simultánea a múltiples objetivos, y/o se pueden conjugar a una o más unidades estructurales sin Fn3 (por ejemplo, unidades estructurales funcionales) , tales como albúmina de suero humana (HSA) , una región Fc de anticuerpo o polietilengicol (PEG) , por ejemplo, para mejorar la semivida y estabilidad de la molécula de unión con base en Fn3.

En otra realización, las moléculas de unión con base en Fn3 monoespecíficas inferiores se pueden combinar con moléculas de unión con base en Fn3 que utilizan los bucles BC, DE, o FG superiores para producir moléculas de unión con base en Fn3 biespecíficas. La descripción de la invención proporciona adicionalmente moléculas de unión 2

con base en Fn3 biespecíficas que se unen a dos o más objetivos de forma simultánea. Estas moléculas de unión con base en Fn3 biespecíficas también se pueden ligar (por ejemplo, en forma similar a perla) para formar moléculas de unión con base en Fn3 multiespecíficas que se unen de forma simultánea a múltiples objetivos, y/o se pueden conjugar a una o más unidades estructurales sin Fn3 (por ejemplo, unidades estructurales funcionales) como se describió anteriormente. La descripción proporciona adicionalmente métodos de detección de colecciones de moléculas de unión con base en Fn3 para unión específica a un objetivo, normalmente una proteína objetivo, así como también métodos para fabricar moléculas de unión con base en Fn3 en, por ejemplo, sistemas procarióticos o eucarióticos. Todavía adicionalmente, la descripción proporciona composiciones (por ejemplo, composiciones terapéuticas) que comprenden moléculas de unión con base en Fn3, y utiliza dichas composiciones en una variedad de aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la descripción proporciona una molécula de unión con base en Fn3 que comprende un dominio Fn3, en donde por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle AB, CD, EF inferiores o el terminal C del dominio de Fn3 se alteran en comparación con un dominio de Fn3 tipo natural (por ejemplo, SEQ ID NO:1) para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un objetivo específico. En una descripción particular, los residuos de aminoácidos alterados en las regiones de bucle AB, CD, EF o terminal C incluyen uno o más de los aminoácidos en las posiciones 15, 16, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 60, 61, 62, 63, 64, 93, 95, o 96 de la SEQ ID NO:1. La secuencia de unión sin Fn3, por ejemplo, puede ser toda o una porción de una región CDR (por ejemplo, una región CDR de anticuerpo) o un receptor de célula T.

En otro aspecto, la descripción se refiere a una molécula de unión con base en Fn3 que comprende un primer dominio de Fn-3, en donde por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle inferiores AB, CD o EF o terminal C del dominio de Fn3 se alteran en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO: para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un primer objetivo, y en donde por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle inferiores AB, CD o EF o terminal C de un segundo dominio de Fn3 se alteran en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO: para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un segundo objetivo.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de unión con base en Fn3 biespecífica que comprende un dominio de Fn3, en donde por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle AB, CD, EF inferiores o terminal C del dominio de Fn3 se alteran en comparación con un dominio de Fn3 tipo natural (por ejemplo, SEQ ID NO:1) para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un primer objetivo, y en donde por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle superiores BC, DE o FG del dominio de Fn3 se alteran en comparación con un dominio de Fn3 tipo natural que comprende (por ejemplo, SEQ ID NO:1) para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un segundo objetivo. En una realización particular, los residuos de aminoácidos alterados en las regiones de bucle AB, CD, EF inferiores o terminal C incluye uno o más de los aminoácidos en la posición de 15, 16, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 60, 61, 62, 63, 64, 93, 95, o 96 de la SEQ ID NO: 1, y los residuos de aminoácidos alterados en las regiones de bucle superiores BC, DE o FG incluye uno o más de los aminoácidos en la posición de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 76, 77, 78, 79, 80, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, o 88 de la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con lo anterior, dichas moléculas de unión con base en FN3 biespecíficas de la invención se unen de forma simultánea a dos o más objetivos presentes en la misma molécula, o en diferentes moléculas.

En otro aspecto, la invención proporciona,... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de unión con base en Fn3 biespecífica que comprende un dominio de Fn3, en donde por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle inferiores AB, CD o EF o terminal C del dominio de Fn3 se altera en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO:1 para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un primer objetivo, y en donde por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle superiores BC, DE o FG del dominio de Fn3 se altera en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO:1 para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un segundo objetivo.

2. La molécula de unión con base en Fn3 biespecífica de la reivindicación 1, en donde dicho por lo menos un aminoácido en dichas regiones de bucle inferiores AB, CD o EF se seleccionan del grupo que consiste de los aminoácidos en la posición de 15, 16, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 60, 61, 62, 63, 64, 93, 95, y 96 de la SEQ ID NO:1, y en donde dicho por lo menos un aminoácido en dichas regiones de bucle superiores BC, DE o FG se selecciona del grupo que consiste de aminoácidos en la posición de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 76, 77, 78, 79, 80, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, y 88 de la SEQ ID NO:1.

3. La molécula de unión con base en Fn3 biespecífica de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de unión sin Fn3 comprende todo o una porción de una región determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo o un receptor de célula T.

4. La molécula de unión con base en Fn3 biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichos primer y segundo objetivos están presentes en la misma molécula.

5. La molécula de unión con base en Fn3 biespecífica de la reivindicación 1 a 2, en donde dichos primer y segundo objetivos están presentes en diferentes moléculas.

6. Una molécula de unión con base en Fn3 biespecífica de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, en donde el primer objetivo es un extensor de semivida.

7. La molécula de unión con base en Fn3 biespecífica de la reivindicación 6, en donde el extensor de semivida es albúmina de suero humana.

8. La molécula de unión con base en Fn3 biespecífica de la reivindicación 6, en donde el segundo objetivo es VEGFR2.

9. La molécula de unión con base en Fn3 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se une a una unidad estructural sin Fn3 que aumenta la semivida de la molécula de unión con base en Fn3.

10. Una molécula de unión con base en Fn3 multiespecífica que comprende dos o más moléculas de unión con base en Fn3 monoespecíficas, en donde por lo menos una molécula de unión con base en Fn3 monoespecífica comprende por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle inferiores AB, CD o EF o terminal C del dominio de Fn3 que se altera en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO: 1 para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un primer objetivo; y una segunda molécula de unión con base en Fn3 monoespecífica que tiene por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle superiores BC, DE o FG del dominio de Fn3 que se altera en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO: 1 para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a un segundo objetivo, en donde la primera y segunda moléculas de unión con base en Fn3 monoespecíficas se conectan mediante una secuencia ligadora.

11. La molécula de unión con base en Fn3 multiespecífica de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente una tercera molécula de unión con base en Fn3 monoespecífica que tiene por lo menos un aminoácido en una o más de las regiones de bucle superiores BC, DE o FG del dominio de Fn3 que se altera en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO:1 para crear una secuencia de unión sin Fn3 que se une a uno o más objetivos, y en donde la segunda y tercera moléculas de unión con base en Fn3 monoespecíficas se conectan mediante una secuencia ligadora.

12. La molécula de unión con base en Fn3 multiespecífica de la reivindicación 10, en donde el primer objetivo es un extensor de semivida.

13. La molécula de unión con base en Fn3 multiespecífica de la reivindicación 12, en donde el extensor de semivida es albúmina de suero humana.

14. La molécula de unión con base en Fn3 multiespecífica de la reivindicación 12, en donde el segundo objetivo es VEGFR2.

15. La molécula de unión con base en Fn3 multiespecífica de la reivindicación 12, en donde la secuencia ligadora es una secuencia ligadora G-S.

16. Una molécula de unión con base en Fn3 biespecífica que comprende la SEQ ID NO: 120.

17. Un conjugado que comprende una molécula de unión con base en Fn3 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes unida a una o más unidades estructurales sin Fn3.

18. El conjugado de la reivindicación 17, en donde la unidad estructural sin Fn3 comprende o se une a una molécula que aumenta la semivida de la molécula de unión con base en Fn3.

19. La molécula de unión con base en Fn3 o conjugado de las reivindicaciones 17-18, en donde la unidad estructural sin Fn3 comprende una molécula seleccionada del grupo que consiste de una región Fc de anticuerpo, albúmina de suero humana (HSA) y polietilengicol (PEG) .

20. La molécula de unión con base en Fn3 o conjugado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende adicionalmente por lo menos un residuo de aminoácido modificado en comparación con el dominio de Fn3 tipo natural que comprende la SEQ ID NO: 1 para adherir una unidad estructural funcional.

21. La molécula de unión con base en Fn3 o conjugado de la reivindicación 20, en donde el residuo de aminoácido modificado comprende la adición o sustitución de un residuo de cisteína o residuo de aminoácido no natural.

22. La molécula de unión con base en Fn3 o conjugado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende hebras beta de dos o más diferentes dominios de Fn3.

23. Una composición que comprende la molécula de unión con base en Fn3 o conjugado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un portador.

24. Una composición que comprende la molécula de unión con base en Fn3 o conjugado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un portador para uso como un medicamento.

25. Una composición para uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el medicamento se utiliza para tratar un sujeto por una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de una enfermedad autoinmune, un cáncer, y una enfermedad infecciosa.

26. Un método pata detectar una proteína en una muestra que comprende etiquetar la molécula de unión con base en Fn-3 o conjugado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, poner en contacto la molécula de unión marcada o conjugado con la muestra, y detectar la formación de complejo entre la molécula de unión con base en Fn3 o conjugado con la proteína.

27. Una colección de ácido nucleicos variegada que codifica moléculas de unión con base en Fn3 de una cualquiera de las reivindicaciones 6 y 10.

Objetivo A Objetivo A Objetivo A

cara superior cara superior cara superior

cara inferior

cara inferior cara inferior

Objetivo A

Objetivo A Objetivo B

cara superior cara superior cara superior cara superior

cara inferior cara inferior cara inferior cara inferior

cara superior cara superior

cara inferior cara inferior

Preescisión His-S

Unión HSA del clon 87