Moduladores de la función de los receptores de FAS y otras proteínas.

Una secuencia de DNA seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de DNA,

SEQ ID NO: 14 o 17;

(b) una secuencia de cDNA que codifica una proteína MACH que comprende SEQ ID NO: 7 o 18;

(c) una secuencia de DNA capaz de hibridarse, en condiciones moderadamente rigurosas, con lassecuencias de (a) o (b), en donde la secuencia de DNA codifica una proteína MACH, que es capaz deunirse a FADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa;

(d) una secuencia de DNA que está degenerada como resultado del código genético dando las secuenciasde DNA definidas en (a) o (b) y que codifica una proteína MACH que es capaz de unirse a FADD/MORT-1 ytiene actividad de proteasa; y

(e) un fragmento del DNA de una cualquiera de (a) a (d) que codifica una proteína que es capaz de unirse aFADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa

Moduladores de la función de los receptores de FAS y otras proteínas Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente al campo de los receptores que pertenecen a la superfamilia de receptores de TNF/NGF y al control de sus funciones biológicas. La superfamilia de receptores de TNF/NGF incluye receptores tales como los receptores del factor de necrosis tumoral, p55 y p75 (los TNF-R, de aquí en adelante llamados p55-R (o p55-TNF-R) y p75-R (o p75-TNF-R) ) y el receptor del ligando FAS (también llamado FAS/APO1 o FAS-R y de aquí en adelante será denominado FAS-R) y otros. Más específicamente, la presente invención se refiere a nuevas proteínas de unión a la proteína MORT-1 (o FADD) , y más específicamente, se refiere a una de dichas proteínas, tal como la proteína de unión a MORT-1, aquí designada MACH.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Antecedentes de la técnica anterior

El factor de necrosis tumoral (TNF-a) y la linfotoxina (TNF-º) (de aquí en adelante, TNF, se refiere tanto a TNF-a como a TNF-º) son citoquinas proinflamatorias multifuncionales formadas principalmente por fagocitos mononucleares, que tienen muchos efectos sobre las células (Wallach, D. (1986) en: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.) , pp. 83-122, Academic Press, London; y Beutler and Cerami (1987) ) . Tanto TNF-a como TNF-º inician sus efectos uniéndose a receptores específicos de la superficie celular. Algunos de los efectos es probable que sean beneficiosos para el organismo: pueden destruir, por ejemplo, células tumorales o células infectadas por virus y aumentar las actividades antibacterianas de los granulocitos. De esta manera, el TNF contribuye a la defensa de los organismos contra tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación de lesiones. Así, el TNF se puede usar como un agente antitumoral en cuya aplicación se une a sus receptores en la superficie de células tumorales e inicia de ese modo los eventos que conducen a la muerte de las células tumorales. El TNF se puede usar también como un agente anti-infeccioso.

Sin embargo, tanto TNF-a como TNF-º también tienen efectos nocivos. Existen pruebas de que la sobreproducción de TNF-a puede desempeñar un papel patógeno principal en varias enfermedades. Por ejemplo, se sabe que los efectos del TNF-a, principalmente, sobre la vasculatura es una causa principal para los síntomas del choque séptico (Tracey et al., 1986) . En algunas enfermedades, el TNF puede causar una pérdida excesiva de peso (caquexia) suprimiendo actividades de adipocitos y causando anorexia, y por eso el TNF-a fue llamado caquetina. Fue también descrito como mediador del daño a tejidos en enfermedades reumáticas (Beutler and Cerami, 1987) y como un mediador principal del daño observado en reacciones de injerto contra hospedante (Piquet et al., 1987) . Además, se sabe que el TNF está implicado en el proceso de inflamación y en muchas otras enfermedades.

Dos receptores distintos, expresados de modo independiente, los p55-TNF-R, y p75-TNF-R, que se unen específicamente tanto al TNF-a como al TNF-º, inician y/o median los efectos biológicos anteriormente mencionados del TNF. Estos dos receptores tienen dominios intracelulares estructuralmente diferentes lo que sugiriere que señalizan de modo diferente (Véase Hohmann et al., 1989; Engelmann et al.; 1990; Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; y Heller et al., 1990) . Sin embargo, aún no han sido elucidados los mecanismos celulares, por ejemplo, las diversas proteínas y posiblemente otros factores, que están implicados en la señalización intracelular de los p55-TNF-R y p75-TNF-R. Es esta señalización intracelular, que tiene lugar normalmente después de la unión del ligando, es decir, TNF (a o º) , al receptor, la que es responsable del comienzo de la cascada de reacciones que dan como resultado final la respuesta observada de la célula al TNF.

En lo que se refiere al efecto citocida del TNF anteriormente mencionado, en la mayoría de las células estudiadas hasta ahora, este efecto es desencadenado principalmente por el p55-TNF-R. Los anticuerpos frente al dominio extracelular (dominio de unión al ligando) del p55-TNF-R, pueden desencadenar ellos mismos el efecto citocida (véase la patente europea EP 412486) que está correlacionado con la efectividad de la reticulación del receptor por los anticuerpos, que se cree que es la primera etapa en la generación del proceso de señalización intracelular. Además, los estudios mutacionales (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) han mostrado que la función biológica del p55-TNF-R depende de la integridad de su domino intracelular, y por consiguiente se ha sugerido que la iniciación de la señalización intracelular que conduce al efecto citocida del TNF tiene lugar como consecuencia de la asociación de dos o más dominios intracelulares del p55-TNF-R. Por otro lado, el TNF (a y º) está presente en forma de un homotrímero, y como tal, se ha sugerido que induce la señalización intracelular vía el p55-TNF-R, por medio de su capacidad para unirse a las moléculas receptoras y reticularse con ellas, es decir, causando la agregación de los receptores.

Otro miembro de la superfamilia de receptores del TNF/NGF es el receptor de FAS (FAS-R) que ha sido también llamado el antígeno FAS, una proteína de la superficie celular expresada en diversos tejidos y que comparte homología con un número de receptores de la superficie celular, incluyendo TNF-R y NGF-R. El FAS-R media la muerte celular en la forma de apoptosis (Itoh et al., 1991) , y parece que sirve como un selector negativo de linfocitos T auto-reactivos, es decir, durante la maduración de los linfocitos T, el FAS-R media la muerte celular apoptótica de los linfocitos T que reconocen auto-antígenos. También se ha encontrado que las mutaciones en el gen FAS-R (lpr) causa un trastorno linfoproliferante en ratones que se parece a la enfermedad autoinmunitaria humana lupus eritematoso sistémico (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992) . Parece que el ligando para el FAS-R es una molécula asociada a la superficie celular llevada por, entre otras, los linfocitos T asesinos (o linfocitos T citotóxicos -CTL) , y de ahí que cuando tales CTL entran en contacto con células que llevan FAS-R, éstas sean capaces de inducir la muerte celular por apoptosis de las células que llevan FAS-R. Además, se ha preparado un anticuerpo monoclonal que es específico para FAS-R, siendo este anticuerpo monoclonal capaz de inducir la muerte celular por apoptosis en células que llevan FAS-R, incluyendo células de ratón transformadas por cDNA que codifica FAS-R humano (Itoh et al., 1991) .

Aunque algunos de los efectos citotóxicos de los linfocitos están mediados por la interacción de un ligando producido por linfocitos con el receptor de la superficie celular FAS-R (CD95) presente de manera abundante, que tiene la capacidad de desencadenar la muerte celular, se ha encontrado también que otras diversas células normales, además de los linfocitos T, expresan el FAS-R en sus superficies y pueden ser destruidas por la reacción desencadenada por este receptor. Se sospecha que la inducción descontrolada de tal proceso de muerte contribuye al daño tisular en ciertas enfermedades, por ejemplo, la destrucción de células hepáticas en la hepatitis aguda. Por consiguiente, encontrar medios para controlar la actividad citotóxica del FAS-R puede tener un potencial terapéutico.

Por el contrario, puesto que también se ha encontrado que ciertas células malignas y células infectadas por VIH llevan el FAS-R en sus superficies, los anticuerpo frente a FAS-R, o el ligando de FAS-R, pueden ser usados para desencadenar los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en estas células y de ese modo proporcionar un medio para combatir tales células malignas o células infectadas por VIH (véase Itoh et al., 1991) . Encontrar aún otros modos para potenciar la actividad citotóxica de FAS-R puede por lo tanto tener también un potencial terapéutico.

Ha sido una necesidad sentida durante mucho tiempo proporcionar un medio para modular la respuesta celular al TNF (a o ) y al ligando de FAS-R. Por ejemplo, en las situaciones patológicas anteriormente mencionadas, en las que el TNF o el ligando de FAS-R están sobre-expresados, es deseable inhibir los efectos citocidas inducidos por TNF o el ligando de FAS-R, mientras que en otras situaciones, por ejemplo, aplicaciones de curación de heridas, es deseable potenciar el efecto del TNF, o en el caso de FAS-R, en células tumorales o células infectadas por VIH, es deseable potenciar el efecto mediado por FAS-R.

El laboratorio... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de DNA seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una secuencia de DNA, SEQ ID NO: 14 o 17;

(b) una secuencia de cDNA que codifica una proteína MACH que comprende SEQ ID NO: 7 o 18;

(c) una secuencia de DNA capaz de hibridarse, en condiciones moderadamente rigurosas, con las secuencias de (a) o (b) , en donde la secuencia de DNA codifica una proteína MACH, que es capaz de unirse a FADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa;

(d) una secuencia de DNA que está degenerada como resultado del código genético dando las secuencias de DNA definidas en (a) o (b) y que codifica una proteína MACH que es capaz de unirse a FADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa; y

(e) un fragmento del DNA de una cualquiera de (a) a (d) que codifica una proteína que es capaz de unirse a FADD/MORT-1 y tiene actividad de proteasa.

2. Un vector que comprende una secuencia de DNA de la reivindicación 1.

3. El vector de la reivindicación 2, capaz de ser expresado un una célula hospedante procariota o eucariota.

4. Células hospedantes procariotas o eucariotas transformadas que contienen un vector de la reivindicación

2.

5. Una proteína MACH codificada por el DNA de la reivindicación 1.

6. Un método para producir una proteína MACH codificada por la secuencia de DNA de la reivindicación 1, que comprende hacer crecer las células hospedantes transformadas de la reivindicación 4 en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, efectuar modificaciones post-traduccionales para obtener dicha proteína y aislar dicha proteína expresada.

7. Anticuerpos específicos para la proteína MACH de la reivindicación 5, o fragmentos Fab o F (ab’) 2 de dichos anticuerpos.

8. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, una proteína MACH de la reivindicación 5 o una proteína aislada según el método de la reivindicación 6, o sus mezclas.

9. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, un vector viral recombinante de animal que codifica una proteína MACH de la reivindicación 5.

10. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de MACH de la reivindicación 1.

11. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, un anticuerpo de la reivindicación 7.

12. Uso de una proteína MACH de la reivindicación 5, o secuencias que codifican dicha proteína, en la preparación de una composición farmacéutica para tratar tumores o inflamación.

13. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de tumores o inflamación, que comprende una proteína MACH de la reivindicación 5 o secuencias que codifican dicha proteína.

FIG 18