METODOS PARA AMPLIFICAR Y SECUENCIAR ADN.
Un método para realizar una reacción de extensión cíclica del cebador que comprende las etapas de:
#(i) poner en contacto un ADN molde que comprende una secuencia de nucleótidos diana con al menos un cebador oligonucleotídico complementario para una secuencia nucleotídica en el extremo 3'' de dicha secuencia diana, bajo condiciones que permiten el apareamiento de dicho cebador con su secuencia nucleotídica complementaria sobre dicha secuencia diana, en presencia de un agente osmoprotector seleccionado de prolina, 2-metil-4-carboxi-3,4,5,6tetrahidropirimidina [THP(B)] y mezclas de los mismos, para disminuir la temperatura de fusión de dicho ADN molde y/o dicho cebador; #(ii) llevar a cabo una extensión, mediada por polimerasa, de dicho cebador sobre dicha secuencia de nucleótidos diana en presencia de un agente osmoprotector seleccionado de prolina, THP(B), 2-metil-4-carboxi-5-hidroxi-3,4,5,6tetrahidropirimidina [THP(A)] y mezclas de los mismos, para estabilizar dicha polimerasa; y #(iii) repetir las etapas (i) y (ii) una pluralidad de veces, donde la etapa (i) está precedida por la desnaturalización térmica del ADN a un temperatura adecuada tanto para separar dicho ADN molde en sus hebras como para separar el cebador extendido por la polimerasa de la etapa (ii) de su secuencia de nucleótidos diana complementaria, siendo dicha temperatura una temperatura en la que la polimerasa usada en la etapa (ii) es estable; donde la prolina está presente en una cantidad de 3,0-5,5 M cuando se usa a solas y en una cantidad de 1-5 M cuando se usa en una mezcla, THP(B) está presente en una cantidad de 0,5-3,5 M y THP(A) está presente en una cantidad de 0,5-3 M; y donde en presencia de prolina a solas se usa una polimerasa no termoestable para realizar la reacción de extensión cíclica del cebador y la prolina permite funcionar a temperaturas a las cuales la polimerasa no termoestable podría, por el contrario, ser sensible a inactivación térmica, obteniendo así una extensión específica del cebador de alto rendimiento sobre dicha secuencia de nucleótidos diana del ADN molde.
Tipo: Resumen de patente/invención.
Solicitante: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY, LTD..
Nacionalidad solicitante: Israel.
Dirección: THE WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE,76 100 REHOVOT.
Inventor/es: LAPIDOT,AVIVA, IAKOBASHVILI,ROBERT, MALIN,GENNADY.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 1 de Abril de 2009.
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
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