Microesferas poliméricas como adyuvantes en la producción de vacunas frente a parásitos escuticociliados de peces.

Microesferas poliméricas como adyuvantes en la producción de vacunas frente a parásitos escuticociliados de peces.

La invención describe el uso de microesferas como adyuvantes en la obtención de una vacuna frente a la escuticociliatosis. La invención proporciona una vacuna que contiene microesferas esféricas de quitosano y un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico, que actúan como adyuvante, estando las microesferas recubiertas con antígeno de membrana de un parásito patógeno del rodaballo, el escuticociliado Philasterides dicentrarchi (sinónimo de Miamiensis avidus). La vacuna es capaz de inducir potentes respuestas inmunitarias y una protección elevada en el rodaballo frente a la escuticociliatosis, cuando es administrada por vía parenteral, mejorando la protección inducida por vacunas que utilizan adyuvantes oleosos conteniendo aceites metabolizables, pero sin producir efectos secundarios indeseables en los peces.

Microesferas poliméricas como adyuvantes en la producción de vacunas frente a parásitos escuticociliados de peces.

Sector de la técnica La presente invención se encuadra dentro del campo de desarrollo de vacunas para patógenos que afectan a especies producidas mediante acuicultura. Más concretamente, la invención describe el uso de microesferas como adyuvantes en la obtención de una vacuna frente a la escuticociliatosis. La invención proporciona una vacuna que contiene microesferas de quitosano y un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico, que actúan como adyuvante, estando las microesferas recubiertas con antígeno de membrana de un parásito patógeno del rodaballo, el escuticociliado Philasterides dicentrarchi (sinónimo de Miamiensis avidus) . La vacuna induce la protección en los peces, por ejemplo, el rodaballo, frente a la escuticociliatosis y supera ventajosamente los inconvenientes existentes en la inmunización con otras vacunas que utilizan componentes oleosos como adyuvantes.

Estado de la técnica

El desarrollo de nuevas vacunas contra patologías emergentes de peces y la mejora de las formulaciones de vacunas convencionales, ha adquirido en los últimos años gran importancia, debida especialmente al gran impacto ocasionado en el ámbito económico y social de la acuicultura (Sommerset, I. et al., 2005. Expert Review of Vaccines 4 (1) :89-101) .

Los preparados de vacunas convencionales incluyen normalmente un antígeno. Los principales inconvenientes que se encuentran son, por un lado, la gran cantidad de antígeno necesario para realizar la vacunación y por otro, que la protección obtenida es generalmente escasa y de corta duración.

Los adyuvantes son agentes farmacológicos o inmunológicos capaces de incrementar el efecto de otros agentes, tales como medicamentos o vacunas. Los adyuvantes son prácticamente inútiles si se administran solos, pero pueden servir para fabricar una vacuna mucho más eficaz. Cuando se administra junto con una vacuna, el adyuvante estimula el sistema inmunitario y aumenta su respuesta a la vacuna. Por todo ello, el desarrollo de nuevas formulaciones de adyuvantes que mejoren la inmunogenicidad de antígenos protectores y que potencien la respuesta inmunitaria del pez está cobrando en la actualidad un gran interés.

Muchas composiciones farmacéuticas de vacunas aplicadas en peces incluyen adyuvantes para aumentar la potencia antigénica, además de mejorar la estabilidad del antígeno o de la formulación. En estos casos, las composiciones de las vacunas disponibles suelen llevar incorporados adyuvantes “de efecto depot” por el que adyuvantes como las sales de aluminio o emulsiones de agua en aceite, mantienen al antígeno atrapado en el sitio de la administración, permitiendo un estímulo inmune prolongado. Este tipo de formulaciones, aunque mejoran la respuesta inmune del pez, acarrean ciertos efectos secundarios cuando se inyectan por vía intraperitoneal como: inflamación local, pérdida de peso, o formación de granulomas o abscesos, por lo que, debido a estos inconvenientes, su uso está a menudo desaconsejado.

Philasterides dicentrarchi es un parasito escuticociliado oportunista que provoca una infección sistémica muy grave en el rodaballo, conocida como escuticociliatosis, invadiendo sus órganos y tejidos (Iglesias R. et al. 2001 Diseases of Aquatic Organisms 46: 47-55) . El parásito entra a través de lesiones de la piel o a través de las branquias (Paramá A. et al. 2003 Aquaculture 217: 73-80) e invade diferentes órganos y tejidos del pez, provocando lesiones muy graves que acaban produciendo su muerte. La escuticociliatosis está directamente relacionada con problemas en la calidad del agua que favorecen la proliferación del parásito (Enfermedades emergentes en la piscicultura marina española. 2007. Servicio de patología de peces. Skretting. Universidad Autónoma de Barcelona) .

La inmunoprofilaxis se presenta como una alternativa a la quimioterapia, ya que permitiría la prevención contra la infección puesto que, en la actualidad, no existen fármacos efectivos para tratarla (Iglesias R. et al. 2008 Diseases of Aquatic Organisms 49: 417-424) . Se han llevado a cabo intentos de obtención de una vacuna eficaz contra la escuticociliatosis en distintos peces planos, pero hasta la fecha ninguna de ellas es totalmente eficaz, sobretodo debido a la existencia de diferentes cepas de ciliadosyala incapacidad de generar protección cuando se inmuniza y se infecta con cepas heterólogas (Piazzón, C. et al. 2008 Fish & Shellfish Immunology 25: 417-424) . Existen algunas formulaciones de vacunas inactivadas efectivas; sin embargo, utilizan una gran cantidad de ciliados completos (106 ciliados/ml) inactivados con formalina y emulsionados en adyuvantes oleosos tipo Montanide (Lamas, J., et al. 2008. Aquaculture 278: 22-26) y cuya seguridad aún no ha sido testada. Estas vacunas inactivadas presentan desventajas relacionadas sobretodo con la gran cantidad de antígeno usada, la necesidad de administrar varias dosis de recuerdo y, además, al no estar sometidas a ningún tipo de purificación, contienen todos los componentes bioquímicos, lo que hace que, por lo general, sean más reactógenas que las vacunas de subunidades, es decir, que provocan mayores efectos secundarios (Salieras, L. 2002. Vacunas 3: 78-84) .

Por ejemplo, experiencias realizadas empleando adyuvante incompleto de Freund y 200 μg de antígeno de inmovilización de Philasterides dicentrarchi por individuo, indicaron que dichos antígenos no eran adecuados para inducir una respuesta inmune en platija, poniendo de manifiesto la dificultad en la selección de antígenos adecuados para la elaboración de vacunas para la escuticociliatosis (Lee, E.H. and Kim, K. H. 2008 Fish & Shellfish Immunology 24: 142e146) . Ensayos de inmunización en rodaballo empleando 400 μg de antígeno de Philasterides discentrarchi por individuo con adyuvante de Freund sí demostraron ser eficaces para proteger a los peces de la infección, pero la toxicidad del adyuvante de Freund lo hace inadecuado para una aplicación comercial (Iglesias R. et al. 2003 Parasitology

126: 125-134) . Por tanto, es deseable obtener una vacuna para prevenir la escuticociliatosis en peces que emplee un adyuvante de menor toxicidad que los empleados actualmente, pero que a su vez potencie la respuesta inmune, de modo que sea posible incorporar una cantidad de antígeno mínima pero suficiente para producir una respuesta inmune en peces.

A este respecto, es muy importante que una vacuna de subunidades como la que se propone (es decir, sin emplear el ciliado completo sino componentes del mismo) , induzca elevados niveles de anticuerpos específicos puesto que, como se ha demostrado recientemente, el control efectivo de la escuticociliatosis inducida por ciliados parásitos, es dependiente, sobre todo, de la acción de los componentes humorales de la respuesta inmunitaria del pez sobre la activación de la vía clásica del complemento, en la que los anticuerpos juegan un papel clave (Leiro J. et al., 2008 Parasite Immunology 30: 535-543) . En peces, se ha demostrado que la vía de administración peritoneal de vacunas es la que genera una mayor respuesta de anticuerpos (Estévez J. et al. 1994. Aquaculture 123: 197-204) .

Se sabe que P. dicentrarchi presenta en su membrana antígenos inmunogénicos que el rodaballo es capaz de reconocer y producir anticuerpos contra ellos en respuesta a una infección natural o bajo distintos protocolos de inmunización ensayados (Piazzon C. et al 2008 Fish and Shelfish Inmunology 25: 417-424) .

Las micropartículas, como sistemas de administración de vacunas, presentan la ventaja de poseer un tamaño similar al de los patógenos que el sistema inmunitario combate y, además, son fácilmente internalizadas por las células presentadoras de antígeno (O’Hagan DT, et al. 2006 Methods 40: 10-19) . Por otro lado, se ha demostrado que las micropartículas con antígenos encapsulados presentan una inmunogenicidad similar a la del adyuvante de Freund (Regueiro González J.R., et al. 2002. Inmunología. Biología y patología del sistema inmune. 3ª Edición. Editorial médica panamérica; capítulo 7) .

La preparación de micropartículas con antígenos encapsulados por métodos o técnicas usados de manera convencional en el campo de la tecnología farmacéutica conlleva, en ocasiones, la degradación de la sustancia activa, debido principalmente a la desnaturalización por el uso de altas temperaturas, disolventes, o las altas fuerzas de cizalla que se emplean en la preparación de las partículas de tamaño micrométrico. Sería por tanto deseable obtener micropartículas capaces de retener al antígeno sin que éste se degrade, para que...

1. Microesferas que comprenden (i) un primer polímero biodegradable de quitosano, o un derivado del mismo, (ii) un segundo copolímero biodegradable de metil vinil éter y anhídrido maleico, o un derivado del mismo, (iii) un agente reticulante y (iv) uno o varios antígenos.

2. Microesferas según la reivindicación 1 donde el antígeno está unido covalentemente a la superficie externa de la microesfera.

3. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones1a2, que se preparan añadiendo antígeno en una proporción de entre 0, 05 y 0, 15% p/v, donde p/v es la proporción entre la cantidad de antígeno en peso y el volumen total de la suspensión en donde se suspenden las microesferas y se disuelve el antígeno.

4. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones1a2, donde la cantidad de antígeno unido a la microesfera es de entre2y7%en peso con respecto al peso de la microesfera.

5. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el antígeno es un componente de un parásito que afecta a peces.

6. Microesferas según la reivindicación 5, donde el antígeno es un componente de al menos uno de los parásitos escuticociliados Philasterides dicentrarchi o Miamiensis avidus.

7. Microesferas según la reivindicación 6, donde el antígeno es un componente de la membrana de al menos uno de los parásitos escuticociliados Philasterides dicentrarchi o Miamiensis avidus.

8. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el agente reticulante se selecciona del grupo que comprende: glutaraldehído, formaldehído, tripolifosfato sódico, genipin, glioxal y etilenglicol diglicidil éter.

9. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones1a8, que se preparan añadiendo un agente reticulante en una proporción de entre 0, 01 y 0, 1% p/v, donde p/v es la proporción entre el peso del agente reticulante y el volumen total de la dispersión de los dos polímeros que forman parte de la microesfera.

10. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones1a9, que se preparan añadiendo el primer polímero en una proporción de entre 0, 12 y 0, 5% (p/v) , y el copolímero en una proporción de entre el 0, 15 y 0, 5% (p/v) , entendiéndose p/v como la proporción entre el peso del polímero o copolímero y el volumen final total de la dispersión de los dos polímeros que forman parte de la microesfera.

11. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde el diámetro de la microesfera está entre 110 μm.

12. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones1a11que comprenden:

i. Polímero de quitosano.

2. 75% (p/p) .

ii. Copolímero de metil vinil éter-anhídrido maleico.

2. 75% (p/p) .

iii. Agente reticulante: 2, 4-5% (p/p) .

iv. Antígeno: 2-7% (p/p) , donde p/p es la proporción entre el peso de cada componente y el peso total de la microesfera.

13. Microesferas según cualquiera de las reivindicaciones1a12 donde dichas microesferas están liofilizadas.

14. Composición farmacéutica que comprende a las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 junto con un medio de dispersión.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación anterior donde el medio de dispersión comprende: carboximetilcelulosa, polisorbato, lecitina, parafina o un aceite natural.

16. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15 donde las microesferas están en una proporción de entre el 0, 1-2% p/v.

17. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15 que comprende:

i. Polímero de quitosano: 0, 25-0, 75% (p/v) .

ii. Copolímero de metil vinil éter-anhídrido maleico: 0, 25-0, 75%. (p/v)

iii. Agente reticulante: 0, 024-0, 05% (p/v) .

iv. Antígeno: 0, 02-0, 07% (p/v) .

v. medio de dispersión.

18. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 para la elaboración de un medicamento para estimular y/o inducir la respuesta inmunitaria en un pez.

19. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 para la elaboración de una vacuna para un pez.

20. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación anterior donde el pez se selecciona del grupo que comprende a los peces planos y a la lubina.

21. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación anterior donde el pez es rodaballo o platija.

22. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde la composición se presenta en forma adaptada a la administración parenteral.

23. Uso de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, donde la composición farmacéutica se administra en una dosis de entre 0, 1 y 0, 5 g por kilogramo de peso del sujeto.

24. Procedimiento de preparación de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende las etapas de:

i. Preparación de una dispersión de un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico en un disolvente orgánico

ii. Preparación de una dispersión de un polímero de quitosano en un disolvente acuoso.

iii. Incorporar la dispersión de la etapa i) con la dispersión de la etapa ii) .

iv. Adición de un agente reticulante.

v. Obtención de las microesferas mediante uno de los procedimientos seleccionados del grupo que comprende: atomización, emulsión/evaporación del disolvente y coacervación.

vi. Unión de un antígeno a la superficie externa de la microesfera.

25. Procedimiento de preparación de las microesferas según la reivindicación 24, donde en la etapa v) la obtención de las microesferas se realiza por atomización.

26. Procedimiento de preparación de las microesferas según la reivindicación 25, donde el procedimiento de atomización tiene lugar bajo las siguientes condiciones: temperatura de atomización: 72ºC, caudal de alimentación: 3-4 ml/min y presión de aire, 500l/h.

27. Procedimiento de preparación de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde en la etapa i) , el disolvente orgánico es acetona, y el copolímero de metil vinil éter se incorpora a una concentración inicial de entre 0, 15 y 0, 5% p/v en relación al volumen total de la dispersión de los dos polímeros.

28. Procedimiento de preparación de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, donde en la etapa ii) , el disolvente es una solución de ácido acético y el polímero de quitosano se emplea en forma de clorhidrato de quitosano, a una concentración inicial de entre 0, 12 y 0, 5% p/v en relación al volumen total de la dispersión de los dos polímeros.

29. Procedimiento de preparación de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, donde en la etapa iii) , la mezcla se realiza con agitación magnética.

30. Procedimiento de preparación de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, donde en la etapa iv) , el agente reticulante es glutaraldehído en una proporción de entre 0, 01 y 0, 1% p/v en relación al volumen total de la dispersión de los dos polímeros.

31. Procedimiento de preparación de las microesferas según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, donde en la etapa vi) , la unión del antígeno a la superficie externa de la microesfera es de tipo covalente.

32. Procedimiento de preparación de las microesferas según la reivindicación 31, donde la unión del antígeno se realiza incorporando una solución de antígeno sobre una suspensión de microesferas obtenidas en la etapa v) , y donde dicha solución de antígeno está en una proporción de entre el 0, 05 y 0, 15% p/v con respecto al volumen total de la suspensión en donde se suspenden las microesferas y se disuelve el antígeno.

33. Procedimiento de preparación de las microesferas según la reivindicación 32, donde la unión del antígeno se realiza incorporando una solución de antígeno al 0, 1% p/v sobre una suspensión de microesferas obtenidas en la etapa v) , manteniendo en agitación y centrifugando para aislar las microesferas.