Métodos y composiciones que se dirigen a la poliubiquitina.

Anticuerpo aislado, o su fragmento de unión al antígeno, que se une de modo específico a la poliubiquitina unida aK63,

en el que el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, no se unen de modo específico a la poliubiquitinaunida a K48 y no se unen de modo específico a monoubiquitina, y en el que la KD del anticuerpo o un fragmento deunión al antígeno para la poliubiquitina unida a K63 is menor o igual a 10 nM, medida mediante resonancia deplasmón de superficie BIAcore, teniendo el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, un sitio de unión alantígeno definido por un dominio VH y un dominio VL, en el que el dominio VH tiene cuatro regiones estructurales ytres regiones hipervariables, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, y el dominio VL tiene cuatro regiones estructurales y tresregiones hipervariables, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3,

teniendo el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, la secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:5, la secuenciade HVR-H2 de SEQ ID NO:60, la secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:6, la secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:3,la secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:8, y la secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:4; o

teniendo el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, la secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:5, la secuenciade HVR-H2 de SEQ ID NO:63, la secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:6, la secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:3,la secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:11, y la secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:4; o

teniendo el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, la secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:5, la secuenciade HVR-H2 de SEQ ID NO:66, la secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:6, la secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:3,la secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:14, y la secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:4.

Métodos y composiciones que se dirigen a la poliubiquitina.

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de los anticuerpos anti-poliubiquitina, y más en concreto, a anticuerpos anti-poliubiquitina que no se unen de modo específico a monoubiquitina y que pueden discriminar entre poliubiquitinas que tienen diferentes enlaces isopeptídicos.

Antecedentes La ubiquitina es una proteína pequeña que tiene importantes papeles reguladores en una amplia variedad de vías celulares. El más conocido es el papel de la ubiquitina en la degradación de proteínas, en la que la unión covalente de la ubiquitina a una proteína diana permite que la proteína diana pueda ser reconocida y destruida por el proteasoma 26S (véase Wilkinson, Semin. Cell Devel. Biol., 11 (3) :141-148 (2000) ) . La regulación de proteína quinasas de diversas vías de señalización también se ha correlacionado con la ubiquitinación (véase Sun y Chen, Curr. Opin. Cell Biol., 16:119-126 (2004) ) . Por ejemplo, la fosforilación de IκB por la IκB quinasa permite la ubiquitinación de IκB y su posterior degradación por el proteasoma 26S; debido a que Iκb es un inhibidor de NFκB, la degradación de IκB activa NFκB (Ghosh y Karin, Cell, 109 (supl.) : S81-S96 (2002) ; Palombella et al., Cell, 78:773785 (1994) ) . La ubiquitinación también media en la reparación del ADN (véase Sun y Chen, Curr. Opin. Cell Biol., 16:119-126 (2004) ) . Después de que el ADN haya sido dañado, la monoubiquitinación del antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) activa a polimerasas tolerantes al daño que son capaces de sintetizar ADN a pesar de cualquier daño en el ADN (Stelter y Ulrich, Nature, 425:188-191 (2003) ) . Otros procesos fisiológicos en los que se sabe que está implicada la ubiquitinación incluyen la división celular, el crecimiento celular, el movimiento celular, y la muerte celular/apoptosis (Johnson, Nat. Cell Biol., 4:E295-E298 (2002) ; Pickart, Mol. Cell., 8:499-504 (2001) ) .

La unión covalente de la ubiquitina, una proteína de 76 aminoácidos, a una proteína diana es un proceso enzimático en tres etapas (Pickart, Annu. Rev. Biochem., 70:503-533 (2001) ) . En primer lugar, la enzima activadora de ubiquitina E1 forma un tioéster de E1-ubiquitina en una reacción dependiente de ATP. La ubiquitina se traslada desde el tioéster de E1-ubiquitina a un miembro de la familia de enzimas conjugadoras de ubiquitina (E2) en la segunda etapa. En la tercera etapa, con la ayuda de una proteína ligasa de ubiquitina (E3) , se forma un enlace isopeptídico entre el extremo terminal carboxilo de la ubiquitina y el grupo ε-amino de un resto lisina sobre la proteína diana. Las enzimas denominadas desubiquitinasas retiran los restos ubiquitina de las proteínas diana (Guterman y Glickman, Curr. Prot. Pep. Sci., 5:201-210 (2004) ) . Para destacar el papel de la ubiquitina como importante molécula reguladora, el genoma humano contiene muchas proteínas diferentes implicadas en la ubiquitinación o la desubiquitinación: hasta la fecha se han identificado al menos 40 E2 diferentes, 500 E3 diferentes, y 80 desubiquitinasas diferentes (Wong et al., Drug. Discov. Today, 8:746-754 (2003) ) .

La ubiquitina constiene siete restos lisina (Lys6, Lys11, Lys27, Lys33, Lys29, Lys48, y Lys63) , y por tanto la propia ubiquitina pueden actúar como proteína diana para la ubiquitinación (Peng et al., Nat. Biotechnol., 21: 921-926 (2003) ; Pickart y Fushman, Curr. Opin. Chem. Biol., 8:610-616 (2004) ) . La molécula producida después de la ubiquitinación de una proteína de ubiquitina se denomina molécula de poliubiquitina, y puede comprender dos o más restos ubiquitina. La ubiquitinación de la ubiquitina puede producirse, en teoría, en cualquiera de los siete restos lisina (Peng et al., Nat. Biotechnol., 21: 921-926 (2003) ) , de modo que existen diferentes especies de poliubiquitina que tienen enlaces isopeptídicos a diferentes restos lisina dentro de la ubiquitina. Es posible que una única molécula de poliubiquitina con más de dos restos restos ubiquitina tenga más de un tipo de enlace de lisina. Los estudios han demostrado que la enzima E2 influye en el tipo de enlace de lisina creado entre una molécula de ubiquitina y otra (Tenno et al., Genes to Cells, 9:865-875 (2004) ; Deng et al. (2000) ; Hofmann y Pickart (2001) ) . La poliubiquitina y la ubiquitina existen ambas como moléculas libres y en unión covalente con una proteína diana.

Al igual que la ubiquitina, se ha descubierto la implicación de la poliubiquitina en muchos procesos celulares, incluyendo el tráfico intracelular, la endocitosis, la expresión/silenciamiento de genes, la proteolisis, la activación de quinasas, la traducción, y la reparación del ADN (Hoege et al., Nature, 419:135-141 (2002) ; Spence et al., Mol. Cell. Biol., 15:1265-1273 (1995) ; Hofmann y Pickart, Cell, 96: 645-653 (1999) ) . Sin embargo, la poliubiquitina y la poliubiquitinación tienen unos papeles fisiológicos notablemente diferentes a los de la monoubiquitina y la monoubiquitinación en las mismas vías. Por ejemplo, mientras que la monoubiquitinación de PCNA después de daños en el ADN produce la activación de ADN polimerasas propensas a errores, la poliubiquitinación de PCNA en el mismo resto en el que se observa la monoubiquitinación produce la activación de la reparación del ADN sin errores (Stelter y Ulrich, Nature, 425:188-191 (2003) ; Hoege et al., Nature, 419:135-141 (2002) ; Spence et al., Mol. Cell. Biol., 15:1265-1273 (1995) ; y Hofmann y Pickart, Cell, 96:645-653 (1999) ) .

Incluso las poliubiquitinas que tienen diferentes enlaces de lisina parecen desempeñar papeles fisiológicos diferentes. Las dos mejor estudiadas son las poliubiquitinas unidas a Lys48 y unidas a Lys63, y los estudios estructurales de ambas sugieren que las poliubiquitinas con diferentes enlaces de lisina pueden adoptar conformaciones muy diferentes, lo cual permite diferentes interacciones con compañeros de unión seleccionados (Tenno et al., Genes to Cells, 9:865-875 (2004) ) . La modificación covalente por la poliubiquitina unida a Lys48

generalmente marca a la proteína diana para la degradación proteolítica, aunque existen pruebas de que la poliubiquitina unida a Lys48 también puede regular ciertas proteínas por medios no proteolíticos (Chau et al., Science, 243:1576-1583 (1989) ; Finley et al., Mol. Cell. Biol., 14: 5501-5509 (1994) ; Flick et al., Nat. Cell. Biol., 6:634-641 (2004) ) . Por contraste, las poliubiquitinas unidas a Lys63 se han relacionado con una diversidad de vías intracelulares no proteolíticas, incluyendo la reparación del ADN (las células de levadura que expresan K63Rubiquitina tienen defectos en la reparación del ADN) , la activación de quinasas, el tráfico intracelular, y la traducción (Pickart y Fushman, Curr. Opin, Chem. Biol. 8:610-616 (2004) ; Hicke y Dunn, Annu Rev. Cell Dev. Biol., 19:141-172 (2003) ; Spece et al., Mol. Cell Biol., 15:1265-1273 (1995) ; Ulrich, Eukar y ot. Cell, 1:1-10 (2002) ; Spence et al., Cell,

102: 67-76 (2000) ; Seibenhener et al., Mol. Cell. Biol., 24 (18) :8055-8068 (2004) ) . En un ejemplo específico, la sinfilina 1 normalmente es ubiquitinada con poliubiquitina unida a K63 por la parkina de una manera independiente de proteasomas, pero la sinfilina 1, de modo alternativo, puede ser marcada para la destrucción mediante una ubiquitinación con poliubiquitina unida a K48 (Lim et al., J. Neurosci., 25 (8) :2002-2009 (2005) ) . Un análisis de sujetos con enfermedad de Parkinson demuestra que la K63-poliubiquitinación de la sinfilina 1 puede estar implicada en la formación de inclusiones de cuerpos de Lewy asociadas con esta enfermedad (Lim et al., J. Neurosci., 25 (8) :2002-2009 (2005) ) .

Otras poliubiquitinas unidas as de lisina no se han estudiado a fondo, en gran medida debido a la dificultad de distinguirlas. Hasta la fecha, los estudios se han basado en células que expresan ubiquitinas mutagenizadas en las que una o más lisinas se han eliminado, en poliubiquitinas sintetizadas de modo enzimático con enlaces concretos, o en técnicas tales como la espectrometría de masas para distinguir entre un tipo u otro de poliubiquitina. Cada una de estas metodologías no está indicada o es incómoda para el análisis del comportamiento fisiológico normal de poliubiquitinas unidas as de lisina concretos. Aunque existen anticuerpos que son específicos para la poliubiquitina, en oposición a la monoubiquitina (Fujimoro et al., FEBS Lett., 349:173-180 (1994) ) , todavía no existen anticuerpos que puedan distinguir entre las poliubiquitinas con diferentes enlaces de lisina.

De modo poco sorprendente, debido a sus importantes papeles en una diversidad de procesos celulares, la ubiquitina... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo aislado, o su fragmento de unión al antígeno, que se une de modo específico a la poliubiquitina unida a K63, en el que el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, no se unen de modo específico a la poliubiquitina unida a K48 y no se unen de modo específico a monoubiquitina, y en el que la KD del anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno para la poliubiquitina unida a K63 is menor o igual a 10 nM, medida mediante resonancia de plasmón de superficie BIAcore, teniendo el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno, un sitio de unión al antígeno definido por un dominio VH y un dominio VL, en el que el dominio VH tiene cuatro regiones estructurales y tres regiones hipervariables, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, y el dominio VL tiene cuatro regiones estructurales y tres regiones hipervariables, HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3,

teniendo el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, la secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:5, la secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:60, la secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:6, la secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:3, la secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:8, y la secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:4; o teniendo el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, la secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:5, la secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:63, la secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:6, la secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:3, la secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:11, y la secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:4; o teniendo el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, la secuencia de HVR-H1 de SEQ ID NO:5, la secuencia de HVR-H2 de SEQ ID NO:66, la secuencia de HVR-H3 de SEQ ID NO:6, la secuencia de HVR-L1 de SEQ ID NO:3, la secuencia de HVR-L2 de SEQ ID NO:14, y la secuencia de HVR-L3 de SEQ ID NO:4.

2. Anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, inhiben la degradación de una proteína poliubiquitinada unida a K63.

3. Anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, modulan, inhiben o estimulan al menos una vía de señalización mediada por la poliubiquitina.

4. Molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación

1.

5. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 4.

6. Célula hospedante que comprende el vector según la reivindicación 5.

7. Línea celular capaz de producir el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1.

8. Método para producir el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1, que comprende cultivar una célula hospedante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo

o un fragmento de unión al antígeno, bajo condiciones en las que se producen el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno.

9. Composición que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. Método para identificar la presencia de una poliubiquitina unida a K63 o de una proteína poliubiquitinada unida a K63 en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1.

11. Método para determinar la presencia de una poliubiquitina unida a K63 o de una proteína poliubiquitinada unida a K63 en una muestra sospechosa de contener una poliubiquitina unida a K63 o una proteína poliubiquitinada unida a K63, que comprende exponer la muestra al menos a un anticuerpo o a un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1, y determinar la unión de dicho al menos un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, a una poliubiquitina unida a K63 o a una proteína poliubiquitinada unida a K63 en la muestra.

12. Método para separar una proteína poliubiquitinada unida a K63 de una proteína poliubiquitinada no unida a K63 en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1.

13. Método para determinar la función y/o la actividad de una poliubiquitina unida a K63 en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, según la reivindicación 1, y evaluar el efecto de dicha etapa de contacto sobre la muestra.