Métodos y composiciones para suministrar polinucleótidos.

Un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo,

que comprende:

un polipéptido del factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) que comprende al menos una caja HMGoperablemente enlazada a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a unaseñal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear, en el que el polipéptido recombinante del grupode movilidad elevada se puede asociar con un polinucleótido para empaquetar el polinucleótido para elsuministro al orgánulo no nuclear.

Métodos y composiciones para suministrar polinucleótidos ANTECEDENTES

1. CAMPO TÉCNICO

La presente descripción se refiere generalmente a composiciones y métodos para el suministro de polinucleótidos, más particularmente a composiciones y métodos para la transfección, por ejemplo transfección de orgánulos.

2. TÉCNICA RELACIONADA

Se han descrito muchas enfermedades mitocondriales que surgen de mutaciones homoplásmicas individuales en ADN mitocondrial (mtDNA) . Estas enfermedades afectan típicamente a tejidos no mitóticos (cerebro, retina, músculo) , presentes con fenotipos variables, y pueden aparecer esporádicamente y son intratables. Cada vez más pruebas implican a las anomalías del mtDNA en enfermedades tales como Parkinson y diabetes tipo II, pero siguen sin estar definidas las mutaciones etiológicas específicas para estas patologías. La comprensión de las relaciones genotipo-fenotipo de mtDNA y el desarrollo de un tratamiento específico para enfermedades a base de mtDNA está impedido por la incapacidad de manipular el genoma mitocondrial.

En el transcurso de la evolución, muchos organismos abordaron la tarea de introducir macromoléculas en células vivas. Aparte de los mecanismos de captación activos o mediados habitualmente por receptores, específicos de células, la solución general que ha surgido independientemente en muchas estirpes se basa en péptidos desarrollados específicamente para interaccionar con e insertarse en membranas bicapa lipídicas. De este modo, las colicinas bacterianas, las porinas humanas, y los dominios de transducción de proteína (PTD) de diversas especies comparten el motivo de una hélice alfa cargada positivamente, frecuentemente con una estructura anfipática, que es capaz de insertarse en membranas lipídicas, y suministrar intracelularmente cargas más grandes. Informes de investigación recientes confirman el uso exitoso de PTD fusionados a proteínas para su suministro a través de fronteras biológicas, incluyendo la barrera hematoencefálica, y la placenta.

Otro aspecto de gran importancia en el suministro de macromoléculas en organismos es la necesidad de protegerlas de la degradación proteolítica, nucleolítica e inmunitaria y su eliminación mientras atraviesan espacios extracelulares. Un enfoque usado a menudo es revestir ADN con proteínas capaces de sobrevivir al duro viaje hasta la diana. Las proteínas de la cápside vírica han tenido bastante éxito, aunque, para los fines de suministrar ADN a seres humanos, sufren un inconveniente significativo – la inmunogenicidad, la capacidad para provocar una fuerte reacción inmunitaria, reduciendo enormemente la eficacia de la terapia génica.

De este modo, existe la necesidad de composiciones y métodos mejorados para el suministro de polinucleótidos al interior de la célula.

Matsuhima et al, J. Biol. Chem., 278 (33) :31149-31158 (2003) en el documento titulado “functional domains of chicken mitochondrial transcription factor A for the maintenance of mitochondrial DNA copy number in lymphoma cell line DT40”, explica los dominios funcionales de varios polipéptidos TFAM.

El documento DE19856052 describe proteínas de fusión obtenidas entre las cadenas pesadas de la toxina tetánica y HMG 1.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido del grupo de movilidad elevada recombinante, o un fragmento del mismo, que comprende:

un polipéptido del factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) que comprende al menos una caja HMG operablemente enlazada a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a una señal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear, en el que el polipéptido del grupo de movilidad elevada recombinante se puede asociar con un polinucleótido para empaquetar el polinucleótido para el suministro al orgánulo no nuclear.

Se proporcionan vehículos de suministro de polinucleótidos no víricos, y métodos para su uso. En general, la descripción proporciona proteínas de unión a polinucleótidos modificadas que comprenden un dominio de transducción de proteína operablemente enlazado a una señal seleccionadora de dianas, por ejemplo una señal seleccionadora de orgánulos no nucleares. Un aspecto proporciona un polipéptido que comprende al menos un dominio de la caja HMG, más típicamente al menos dos dominios de la caja HMG y al menos un dominio de transducción de proteína. El polipéptido se puede asociar con un polinucleótido, haciendo que el polinucleótido se condense. El polipéptido también puede revestir al polinucleótido. El revestimiento y/o condensación del polinucleótido ayuda a proteger de la degradación al polinucleótido. El dominio de transducción de proteína ayuda al complejo polipéptido-polinucleótido a atravesar membranas y a entrar en el interior de la célula o un orgánulo. La señal seleccionadora de dianas ayuda a dirigir el complemento hacia un sitio de interés, y suministrar de ese modo el polinucleótido.

Las composiciones descritas se pueden usar para suministrar polinucleótidos a localizaciones específicas en una célula, incluyendo, pero sin limitarse a, mitocondrias y cloroplastos. En algunos aspectos, los polinucleótidos codifican una proteína terapéutica o una proteína que compensa proteínas no funcionales o la ausencia de proteínas. En consecuencia, algunos aspectos proporcionan métodos para tratar enfermedades, por ejemplo enfermedades relacionadas con mitocondrias o cloroplastos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un diagrama de un diseño de plásmido ejemplar (izquierda) y una estructura proteica ejemplar (derecha) para TFAM con un dominio PTD seguido de una MLS.

La Figura 2 es un panel de micrografías de fluorescencia que muestra el transcurso de tiempo de mtDNA marcado con Alexa 488 (verde) complejado con PTD-MLS-TFAM añadido a células Sy5y. Red = MitoTracker Red.

Las Figuras 3A-C son micrografías de fluorescencia que muestran la tinción con MtRed y BrdU (FITC) de células rho0 (A) , SY5Y normales (B) y rho0 16 h después de la transfección con mtDNA complejado con PTD-MLS-TFAM (C) .

La Figura 4 es un gel de agarosa de productos de la PCR que amplifica la región alrededor de la mutación LHON 11778A después de SfaN1. Línea 1 - cíbrido LHON; Línea 2 - Sy5y; Línea 3 - Rho0; Línea 4 - Rho0 transfectada con LHON mtDNA; Línea 5 - Rho0 transfectada sin ADN.

La Figura 5A es una micrografía de fluorescencia que muestra células SY5Y normales 24 horas después de la transfección con mtDNA-MtEGFP clonada como un gen de fusión con ND6 en el sitio BamHI de mtDNA y coteñida con MiitoTracker Red.

La Figura 5B es una inmunotransferencia para EGFP usando anticuerpo JL-8 (Clontech) que muestra un producto de fusión proteico de 45 kDa entre ND6 y EGFP (flecha superior) , así como la EGFP de 33 kDa (flecha inferior) .

La Figura 6 es una inmunotransferencia de mtEGFP al silenciar con siRNA a PoIG después de cinco días. La línea final muestra el fracaso de EGFP siRNA para lograr el silenciamiento en un marco de tiempo similar.

La Figura 7A es un diagrama esquemático ejemplar de mtEGFP que contiene una señal de localización nuclear (NLS) y PTD clonado en mtDNA que contiene nuevos sitios de restricción, BgIII y NotI.

Las Figuras 7B-C son micrografías de fluorescencia que muestran células Sy5y que expresan NLS-mtEGFP-PTD que localiza a mitocondrias y el núcleo. (C) Las células se contratiñen con Mito Tracker Red.

La Figura 8A es un diagrama esquemático ejemplar del sitio BamHI erradicado en mtDNA, y BamHI-cDNA clonado en mtDNA.

La Figura 8B es un gel 24 horas después de la transfección, que muestra el fragmento de la PCR de mtDNA procedente de células que se digirieron con BamHI. La línea 1 no se digirió, y la línea 2 de mtDNA de control se digirió.

La Figura 8C es un gel que muestra lisados mitocondriales de células que se incubaron con ADN que contiene un sitio BamHI. Las células del control (línea 1) no muestran actividad de BamHI, mientras que las células transfectadas (línea 2) poseen actividad de BamHI.

La Figura 9 es un gel que muestra PTD-BgIII recombinante dirigido a mitocondrias que provocó la eliminación rápida de la proteína mtEGFP en células que expresan un mtDNA que posee un sitio de restricción BgIIImtEGFP, durante un período de tiempo de 5 días.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

1. Definiciones Al describir y reivindicar la materia objeto descrita, se usará la siguiente terminología según las definiciones expuestas más abajo.

El término “polipéptidos” incluye proteínas y sus fragmentos. Los polipéptidos... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, que comprende:

un polipéptido del factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) que comprende al menos una caja HMG operablemente enlazada a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a una señal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada se puede asociar con un polinucleótido para empaquetar el polinucleótido para el suministro al orgánulo no nuclear.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada se asocia con 10 a 100 nucleótidos de un polinucleótido que se va a suministrar a un orgánulo seleccionado como diana, y de ese modo empaqueta el polinucleótido para el suministro al orgánulo seleccionado como diana.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada comprende una secuencia seleccionada de SEC ID NO. 210, o un fragmento de la misma, suficiente para la unión a un polinucleótido.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la señal seleccionadora de dianas comprende una señal de localización mitocondrial o una señal de localización de cloroplastos.

5. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que la señal de localización mitocondrial comprende una secuencia que tiene una homología de.

8. 100% con una señal de localización mitocondrial derivada de una proteína seleccionada del grupo que consiste en hexocinasa I, amino oxidasa (que contiene flavina) A, hexocinasa IV, forma celular beta pancreática, proteína relacionada con el receptor periférico de benzodiazepinas, metaxina 2, receptor de importación de proteína de membrana externa mitocondrial putativa (hTOM) , glutationa transferasa; canal aniónico 2 dependiente del voltaje (proteína de membrana mitocondrial externa porínica) , citocromo b5, receptor periférico de benzodiazepinas, anclaje de cinasa de célula germinal S-AKAP84, proteína de anclaje de cinasa A, precursor de carnitina O-palmitoiltransferasa I, hexocinasa II, amino oxidasa (que contiene flavina) B, ácido graso de cadena larga-CoA ligasa 2, ácido graso de cadena larga-CoA ligasa 1 (palmitoil-CoA ligasa) , canal aniónico 1 dependiente del voltaje, metaxina 1, translocasa de 34 kDa de membrana mitocondrial externa putativa humana hTOM34, canal aniónico 4 dependiente del voltaje (proteína porínica de la membrana mitocondrial externa) , citocromo-b5 reductasa, canal aniónico 3 dependiente del voltaje (proteína porínica de la membrana mitocondrial externa) , homólogo de la subunidad TOM20 del receptor de importación mitocondrial (proteína de la membrana externa de 20 kd mitocondrial) (receptor de la membrana mitocondrial externa TOM20) , precursor del homólogo de discos marginales tumorosos (HTID-1) , SEC ID Nos. 18-51, SEC ID Nos.

5. 188 y el polipéptido codificado por SEC ID No: 52.

6. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que la señal de localización de cloroplastos tiene una homología del 80100% con una señal de localización de cloroplastos derivada de una proteína seleccionada del grupo que consiste en el dominio peptídico de tránsito de la proteína ribosomal de apicoblasto S9, péptido de señal de glutationa reductasa (GR) del guisante, término NH2 de Cr-RSH que codifica una guanosina 3’, 5’-bispirofosfato (ppGpp) sintasa-degradasa putativa, proteínas 14-3-3, partícula de reconocimiento de la señal de cloroplastos que incluye las subunidades cpSRP54, cpSRP43 o un fragmento de las mismas, péptidos de tránsito de cloroplastos AtOEP7 que incluye el dominio transmembránico (TMD) y su región de siete aminoácidos vecinos C-terminal, péptido de tránsito cloroplástico N-terminal THI 1, SEC. ID Nos.

19. 203, el polipéptido codificado por SEC ID No: 189, el polipéptido codificado por SEC ID No: 204 y el polipéptido codificado por SEC ID No: 205.

7. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el dominio de transducción de proteína comprende una pluralidad de restos de aminoácidos que tienen una carga neta positiva en condiciones fisiológicas.

8. El polipéptido de la reivindicación 7, en el que el dominio de transducción de proteína comprende 8-15 restos de aminoácidos.

9. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el dominio de transducción de proteína comprende 11 restos de arginina.

10. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el dominio de transducción de proteína se selecciona del grupo que consiste en YGRKKRRQRRR (SEC. ID. NO.: 1) , RKKRRQRRR (SEC. ID. NO. 2) , aminoácido.

4. 60 de la proteína de HIV-1 TAT, la tercera hélice de homeodominio de Antennapedia, RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC. ID. NO.: 207) , una región de poliarginina, 7 restos de arginina, RRQRRTSKLMKR (SEC. ID. NO.: 7) , GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEC. ID. NO.: 8) , WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (SEC. ID. NO.: 9) , un fragmento de los mismos, o una combinación de los mismos.

11. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el dominio de transducción de proteína facilita el atravesamiento de una membrana, y en el que la membrana es una membrana celular, una membrana plasmática, una membrana de orgánulo, una membrana de micela, una membrana bicapa, una membrana de una sola capa, una membrana de vesícula, una membrana nuclear, o una membrana mitocondrial.

12. Una composición que comprende:

(a) un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, comprende un polipéptido del factor A de transcripción mitocondrial (TFAM) que comprende al menos una caja HMG enlazada operablemente a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a una señal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear, y

(b) un polinucleótido,

en la que el polinucleótido está asociado físicamente con el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o fragmento del mismo.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que la asociación física protege al polinucleótido de la degradación.

14. La composición de la reivindicación 12, en la que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, se une de forma reversible a una región del polinucleótido.

15. La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido comprende un promotor enlazado operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, siRNA, o un polinucleótido antisentido.

16. La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido comprende ARN, ADN, o una combinación de los mismos.

17. La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido comprende un dominio enzimático.

18. La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido comprende ARN enzimático o ADN enzimático.

19. La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido es monocatenario o multicatenario.

20. El polipéptido o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para uso en terapia.

21. Un método in vitro de empaquetamiento de un polinucleótido, que comprende:

combinar un polinucleótido con una cantidad de un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada suficiente para empaquetar el polinucleótido,

en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada comprende un polipéptido TFAM que comprende al menos un dominio de la caja HMG operablemente enlazado a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a una señal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear,

en el que el dominio de transducción de proteína y la señal seleccionadora de dianas se presentan sobre una superficie exterior del polinucleótido empaquetado.

22. El método de la reivindicación 21, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada se asocia reversiblemente con el polinucleótido.

23. El método de la reivindicación 21, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada reviste al polinucleótido.

24. El método de la reivindicación 21, en el que la asociación del polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada con el polinucleótido induce a un cambio conformacional en el polinucleótido.

25. El método de la reivindicación 21, en el que el dominio de la caja HMG se asocia con el polinucleótido de una manera específica de la secuencia.

26. El método de la reivindicación 21, en el que el dominio de la caja HMG se asocia de forma no específica con el polinucleótido.

27. El método de la reivindicación 21, en el que la etapa de combinación se produce in vitro.

28. Un complejo de polinucleótido-polipéptido, comprendiendo el complejo de polinucleótido-polipéptido:

(1) un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada que comprende un polipéptido TFAM que comprende al menos una caja HMG operablemente enlazada a un dominio de transducción de proteína que está operablemente enlazado a una señal seleccionadora de orgánulos no nucleares, y

(2) un polinucleótido que codifica un primer polipéptido enzimático o un ácido nucleico enzimático y al menos un segundo polipéptido.

29. El complejo de la reivindicación 28, en el que el polinucleótido comprende un genoma mitocondrial o un fragmento del mismo.

30. El complejo de la reivindicación 28, en el que el orgánulo no nuclear es una mitocondria.

31. El complejo de la reivindicación 28, en el que el primer polipéptido enzimático es una endonucleasa.

32. El complejo de la reivindicación 28, en el que el ácido nucleico enzimático comprende ADN, ARN, o una combinación de los mismos.

33. El complejo de la reivindicación 28, en el que el polinucleótido codifica más de un polipéptido mitocondrial.