Método para medir la actividad de la plasmina de micropartículas presentes en una muestra de un fluido biológico y uso del mismo.

Método para la medición de la actividad de la plasmina de las micropartículas aisladas,

particularmente de lasmicropartículas circulantes de una muestra de sangre, previamente extraída, en el cual

- en una primera etapa se aíslan dichas micropartículas presentes en dicha muestra, según unprocedimiento en el cual

o en una etapa 1A se centrifuga un volumen comprendido entre 500 μl y 5 ml de una muestra desangre previamente extraída, a una velocidad comprendida entre 1000 g y 2000 g, durante untiempo comprendido entre 5 minutos y 20 minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y6ºC;

o en una etapa 1B se centrifuga el sobrenadante obtenido en la etapa 1A a una velocidadcomprendida entre 10000 g y 20000 g, durante un tiempo comprendido entre 1 minuto y 5minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1C se centrifuga el sobrenadante obtenido en la etapa 1B a una velocidadcomprendida entre 15000 g y 25000 g, durante un tiempo comprendido entre 45 minutos y 120minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1D se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1C en un volumen comprendidoentre 250 μl y 4 ml de tampón fosfato salino (PBS) y se centrifuga la mezcla a una velocidadcomprendida entre 15000 g y 25000 g, durante un tiempo comprendido entre 45 minutos y 120minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1E se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1D en un volumen comprendidoentre 250 μl y 4 ml de tampón fosfato salino (PBS) y se centrifuga la mezcla a una velocidadcomprendida entre 15000 g y 25000 g, durante un tiempo comprendido entre 45 minutos y 120minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1F se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1E en un volumen comprendidoentre 20 μl y 500 μl de tampón fosfato salino (PBS).

- en una segunda etapa se mide, por cualquier método apropiado, la capacidad de dichas micropartículasaisladas en la etapa 1 para generar plasmina, y

- en una tercera etapa se compara el resultado de la medida obtenida en la etapa 2 con el resultado de unamedida idéntica realizada en las mismas condiciones en una muestra de sangre idéntica, testigo.

Método para medir la actividad de la plasmina de micropartículas presentes en una muestra de un fluido biológico y uso del mismo La invención tiene por objeto un método para medir la actividad de la plasmina de micropartículas, particularmente de las micropartículas circulantes presentes en una muestra de sangre, tal como se define en la reivindicación 1, pudiendo servir dicho método como método de diagnóstico o como método de seguimiento de un tratamiento.

Las micropartículas resultantes de las gemaciones de la membrana celular fueron descritas en diversos modelos celulares y en numerosas condiciones patológicas como marcadores fiables de la activación y/o apoptosis celular.

Particularmente, los inventores describieron inicialmente la liberación de estas micropartículas por las células endoteliales en respuesta a una estimulación inflamatoria y al aumento de la cantidad de micropartículas endoteliales circulantes en pacientes que presentan el riesgo de trombosis. Puesto que, los niveles elevados de micropartículas endoteliales circulantes fueron descritas en diferentes condiciones patológicas tales como los síndromes coronarios, insuficiencia renal, diabetes, síndrome de los antifosfolípidos (SALP) , púrpura trombótica trombocitopénica (PTT) o también drepanocilosis, los trastornos en los cuales la presencia de micropartículas refleja disfuncionalidades endoteliales es indicativo de un mal pronóstico.

Las micropartículas que expresan diversos componentes bioactivos procedentes de las células de las cuales se derivan, pueden presentar una amplia gama de actividades biológicas capaces de modular las funciones de las células endoteliales o sanguíneas, de influir sobre la homeostasis vascular y participar en las respuestas inflamatorias o en la angiogénesis.

Por ejemplo, las micropartículas, particularmente las micropartículas circulantes, presentan superficies fosfolipídicas procoagulantes implicadas en el ensamblaje y la activación de los factores de la coagulación.

Además, la participación de micropartículas, particularmente de las micropartículas circulantes, en la generación de trombina resulta de su capacidad de expresar, transferir o inducir el factor tisular en el compartimento vascular.

Entre los principales reguladores del equilibrio hemostático, el sistema de activación del plasminógeno es la principal vía fisiológica para la disolución del coágulo de fibrina. Esta vía facilita igualmente la angiogénesis ayudando a la proteolisis de los componentes de la matriz extracelular.

La conversión del plasminógeno en plasmina activa depende de dos serin-proteasas: el activador tisular del plasminógeno (t-PA: tejido de tipo plasminógeno activador) que en los vasos está principalmente implicado en la fibrinolisis, y la uroquinasa (u-PA; uroquinasa de tipo plasminógeno activador) que, unida a su receptor específico, uPAR, está implicada en la proteolisis pericelular.

La generación de plasmina inducida por la uPA y la activación de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) que de ello resulta, favorece la migración de células a través de la matriz intersticial y participa en los procesos tales como el remoldeado tisular, la invasión metastásica y la angiogénesis.

Una activación no controlada y/o excesiva del plasminógeno puede tener consecuencias deletéreas induciendo el desprendimiento celular y/o la apoptosis celular. Se entiende, por lo tanto, que la regulación de la expresión de la plasmina en la superficie de las células, particularmente de las células endoteliales, es de importancia crítica en la regulación de la homeostasis vascular.

El documento Graves Laura E et al, (Cancer Research 64, 7045-7049, 1 octubre 2004) describe un método para la medición de la actividad de la plasmina de las vesículas unidas a las membranas aisladas de muestras de ascitis. El documento de JY W. et al. (“Measuring circulating cell-derived microparticles”, Journal of thrombosis and haemostasis, vol. 2, nº 10, 1 octubre 2004, páginas 1842-1843) describe, en referencia a él, diferentes métodos para aislar las micropartículas.

En la lectura de lo precedente se entiende, por lo tanto, el interés que existe, por una parte en poder evaluar la generación de la “actividad de la plasmina” de las micropartículas, particularmente de las micropartículas circulantes, en un fluido biológico, particularmente en un fluido biológico en situación de flujo, muy particularmente sangre, o en extractos tisulares y, por otra parte, en poder modular esta actividad.

Por “fluido biológico” se entiende cualquier líquido corporal extraíble como, por ejemplo, sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR) , líquido bronco-alveolar (LBA) , orina, líquido sinovial, lecha materna, saliva, lágrimas, líquido seminal, líquidos de ascitis, derrame pleural, líquido amniótico.

Por “fluido biológico en situación de flujo” se entiende cualquier líquido corporal que fluye dentro o fuera del cuerpo de forma natural como, por ejemplo la sangre en circulación, leche materna, orina, saliva, lágrimas, líquido seminal, flujo menstrual y cualquier otro flujo seroso y/o mucoso.

Entre las fuentes de extractos tisulares se pueden citar las placas de ateroma o cualquier otro tejido obtenido por cirugía.

Por “actividad de la plasmina” se debe entender en el presente texto la capacidad de una muestra de fluido biológico, particularmente un fluido biológico en situación de flujo que contiene micropartículas, particularmente micropartículas circulantes, de generar plasmina, cualquiera que sea el mecanismo empleado.

Como método de diagnóstico, el valor de la “actividad de la plasmina de la muestra testada”, medida en la muestra de fluido biológico que contiene micropartículas, particularmente micropartículas circulantes, y comparada con la medida de esta misma capacidad en una muestra testigo obtenida de individuos denominados normales, es decir que no presentan ninguna patología, si es significativamente superior a la del testigo, reflejará, por ejemplo, y sin limitación, para un individuo, un riesgo más o menos elevado de sufrir por ejemplo accidentes vasculares causado por una inestabilidad acusada de las placas de ateroma, un riesgo más o menos elevado para un individuo afectado por un cáncer de sufrir una invasión metastásica o, también para un individuo un riesgo más o menos elevado de sufrir un accidente cerebrovascular y sus consecuencias deletéreas sobre el funcionamiento cerebral. Si este valor de la “actividad de la plasmina de la muestra testada” es inferior a la del testigo, entonces ésta reflejará, por ejemplo para el individuo cuya sangre ha sido testada, un riesgo acrecentado de trombosis.

Como seguimiento de un tratamiento, el valor de la “actividad de la plasmina de la muestra testada”, medida en las micropartículas, particularmente las micropartículas circulantes, de una muestra de fluido biológico, particularmente un fluido biológico en situación de flujo de un individuo en curso de tratamiento, y comparada con la medición de esta misma capacidad en una muestra testigo obtenida del mismo individuo antes del tratamiento o anteriormente en el tratamiento, permite seguir la evolución de la respuesta de dicho individuo en función del tratamiento que le ha sido administrado.

No obstante, existe siempre la necesidad de un ensayo simple, eficaz y fiable, de los riesgos a los que se expone un paciente, ligados a una actividad de la plasmina demasiado fuerte o demasiado débil de su sangre o, también, un ensayo sencillo para seguir la evolución de un tratamiento que pretende modular la actividad de la plasmina de las micropartículas, particularmente de las micropartículas circulantes, de un fluido biológico, particularmente un fluido biológico en situación de flujo de un individuo.

Uno de los objetivos de la presente invención es suministrar un ensayo de este tipo.

En efecto, después de amplios trabajos y de manera sorprendente, los inventores han puesto de manifiesto y en su buen saber por primera vez, que las micropartículas circulantes presentes en un fluido biológico, particularmente en un fluido biológico en situación de flujo, particularmente en la sangre de un individuo, son portadoras de una actividad biológica que las confiere la capacidad de generar plasmina.

En base de este descubrimiento, la presente descripción tiene por objeto un método para la medición de la actividad de la plasmina de micropartículas, particularmente las micropartículas circulantes, de una muestra de fluido biológico, particularmente un fluido biológico en situación de flujo,... [Seguir leyendo]

1. Método para la medición de la actividad de la plasmina de las micropartículas aisladas, particularmente de las micropartículas circulantes de una muestra de sangre, previamente extraída, en el cual

- en una primera etapa se aíslan dichas micropartículas presentes en dicha muestra, según un 5 procedimiento en el cual

o en una etapa 1A se centrifuga un volumen comprendido entre 500 μl y 5 ml de una muestra de sangre previamente extraída, a una velocidad comprendida entre 1000 g y 2000 g, durante un tiempo comprendido entre 5 minutos y 20 minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1B se centrifuga el sobrenadante obtenido en la etapa 1A a una velocidad comprendida entre 10000 g y 20000 g, durante un tiempo comprendido entre 1 minuto y 5 minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1C se centrifuga el sobrenadante obtenido en la etapa 1B a una velocidad

comprendida entre 15000 g y 25000 g, durante un tiempo comprendido entre 45 minutos y 120 15 minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1D se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1C en un volumen comprendido entre 250 μl y 4 ml de tampón fosfato salino (PBS) y se centrifuga la mezcla a una velocidad comprendida entre 15000 g y 25000 g, durante un tiempo comprendido entre 45 minutos y 120 minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1E se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1D en un volumen comprendido entre 250 μl y 4 ml de tampón fosfato salino (PBS) y se centrifuga la mezcla a una velocidad comprendida entre 15000 g y 25000 g, durante un tiempo comprendido entre 45 minutos y 120 minutos, a una temperatura comprendida entre 2 y 6ºC;

o en una etapa 1F se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1E en un volumen comprendido 25 entre 20 μl y 500 μl de tampón fosfato salino (PBS) .

-en una segunda etapa se mide, por cualquier método apropiado, la capacidad de dichas micropartículas aisladas en la etapa 1 para generar plasmina, y

-en una tercera etapa se compara el resultado de la medida obtenida en la etapa 2 con el resultado de una medida idéntica realizada en las mismas condiciones en una muestra de sangre idéntica, testigo.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha muestra de sangre idéntica, testigo, es una muestra de sangre procedente de al menos un individuo considerado como sano, o es sangre procedente del mismo individuo pero obtenida en una extracción anterior a la que ha dado la muestra testada, por ejemplo antes del comienzo de un tratamiento.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la primera etapa de dicho método (aislamiento de las micropartículas, particularmente las micropartículas circulantes, presentes en la muestra) , se realiza según un procedimiento en el cual,

+ en la etapa 1A el volumen de la muestra de sangre está comprendido preferentemente entre 1 ml y 2 ml, se centrifuga a una velocidad comprendida preferentemente entre 1200 g y 1800 g, durante un tiempo comprendido preferentemente entre 10 y 15 minutos, a una temperatura comprendida preferentemente entre 3 y 5ºC;

+ en la etapa 1B se centrifuga el plasma o sobrenadante obtenido en la etapa 1A a una velocidad comprendida preferentemente entre 12000 g y 15000 g, durante un tiempo comprendido preferentemente entre 2 y 3 minutos, a una temperatura comprendida preferentemente entre 3 y 5ºC;

+ en la etapa 1C se centrifuga el sobrenadante obtenido en la etapa 1B a una velocidad comprendida

preferentemente entre 18000 g y 22000 g, durante un tiempo comprendido preferentemente entre 60 y 100 minutos, a una temperatura comprendida preferentemente entre 3 y 5ºC;

+ en la etapa 1D se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1C en un volumen comprendido preferentemente entre 1 y 2 ml de tampón fosfato salino (PBS) y se centrifuga la mezcla a una velocidad comprendida preferentemente entre 18000 g y 22000 g, durante un tiempo comprendido preferentemente 50 entre 60 y 100 minutos, a una temperatura comprendida preferentemente entre 3 y 5ºC;

+ en una etapa 1E se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1D en un volumen comprendido preferentemente entre 1 y 2 ml de tampón fosfato salino (PBS) y se centrifuga la mezcla a una velocidad comprendida preferentemente entre 18000 g y 22000 g, durante un tiempo comprendido preferentemente entre 60 y 100 minutos, a una temperatura comprendida preferentemente entre 2 y 6ºC, preferentemente entre 3 y 5ºC:

+ en una etapa 1F se recoge el coágulo obtenido en la etapa 1E en un volumen comprendido 5 preferentemente entre 50 y 100 μl de tampón fosfato salino (PBS) .

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la segunda etapa de dicho método (medición de la capacidad de dichas micropartículas para generar plasmina) se realiza directamente sobre la cantidad de micropartículas obtenidas a partir de la primera etapa.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la segunda etapa de

dicho método (medición de la capacidad de dichas micropartículas para generar plasmina) se realiza sobre una determinada cantidad de micropartículas obtenidas a partir de la primera etapa.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha cantidad está comprendida entre 10000 y 100000 micropartículas , preferentemente entre 100000 y 300000 micropartículas .

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 5 ó 6, caracterizado porque comprende una

etapa suplementaria (etapa 1bis) de recuento de dichas micropartículas obtenidas a partir de la primera etapa, intercalándose dicha etapa de recuento entre la primera y la segunda etapa del método.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque el recuento de dichas micropartículas se realiza por citometría de flujo.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la segunda etapa de

dicho método, es decir la medición de la capacidad de dichas micropartículas aisladas en la etapa 1 para generar plasmina, se determina o bien por la medición de la cantidad de plasmina espontáneamente presente sobre dichas micropartículas, o bien por medición de la cantidad de plasmina susceptible de ser producida por estas micropartículas.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la medición de la cantidad de plasmina espontáneamente presente sobre dichas micropartículas se realiza por cualquier método conocido como, por ejemplo, por una medición inmunológica con ayuda de anticuerpos antiplasmin (ógenos) o también por espectrometría por lectura de la absorción de la muestra a 405 nm con ayuda de sustratos cromogénicos selectivos de la plasmina.

11. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque la medición de la cantidad de plasmina susceptible 30 de ser producida por dichas micropartículas se realiza según un procedimiento en el cual

-en una etapa 2-1 se añade a las micropartículas obtenidas en la etapa 1 o en la etapa 1bis de dicho método, plasminógeno, ventajosamente purificado, en una cantidad final comprendida entre 0, 1 μM y 2, 0 μM, preferentemente entre 0, 5 μM y 1 μM, y un sustrato cromogénico selectivo de la plasmina, en una cantidad final comprendida entre 0, 50 mM y 1, 0 mM, preferentemente entre 0, 65 mM y 0, 85 mM;

- en una etapa 2-2 se incuba la mezcla obtenida en la etapa 2-1, por ejemplo en una estufa de secado, a una temperatura comprendida entre 25ºC y 45ºC, preferentemente 30ºC y 40ºC, durante un tiempo comprendido entre 30 minutos y 90 minutos, preferentemente entre 50 y 70 minutos, y

- en una etapa 2-3 se detecta por fotometría la cantidad de plasmina susceptible de ser producida, por lectura de la absorción de la muestra a 450 nm

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque de la etapa 2-1, el sustrato selectivo de la plasmina es un sustrato fluorescente como, por ejemplo, el H-U-Val-Leu-Lys-7-amido-4-metilcumarina (Bachem, Bubendorf, Suiza) o D-AFK-ANSNH-iC4H9.2HB (Haematologic Technologies Inc, Vermont EE.UU) .

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la segunda etapa de 45 dicho método, es decir la medición de la capacidad de dichas micropartículas aisladas en la etapa 1 para generar plasmina , se realiza en un volumen final comprendido entre 25 μl y 150 μl, preferentemente entre 50 μl y 100 μl.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la segunda etapa de dicho método, es decir la medición de la capacidad de dichas micropartículas aisladas en la etapa 1 para 50 generar plasmina, se realiza en un tampón fosfato salino (PBS) suplementado con seroalbúmina bovina (Bovine Serum Albumin: BSA) a una concentración comprendida entre 1, 0 y 3, 0 mg/ml, preferentemente entre 1, 5 y 2, 5 mg/ml.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende, además, una etapa 1ter de aislamiento de dichas micropartículas en función de su origen.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque dichas micropartículas aisladas en la etapa 1 están inmovilizadas sobre el soporte en el cual se realiza la etapa 2.

17. Método según la reivindicación 16, caracterizado porque dichas micropartículas aisladas de la etapa 1 están inmovilizadas sobre el soporte con ayuda de un compuesto apto para inmovilizar dichas micropartículas, habiéndose fijado previamente dicho compuesto a la superficie de dicho soporte.

18. Método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicho soporte apto para inmovilizar dichas micropartículas se selecciona entre la anexina V, los anticuerpos específicos de los complejos glicoprotéicos conformacionales activos y/o funcionales de las membranas GPIIb/GPIIIa, los receptores adhesivos de los monocitos o los linfocitos LFA-1, la trombomodulina endotelial o también el CD 146 o, también, un policatión como la poli-L-lisina.

19. Utilización de micropartículas circulantes presentes en una muestra de sangre, en un método de medición de la actividad de la plasmina de dicha muestra de sangre según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 18.

20. Utilización de un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en un método de diagnóstico en un individuo cuya sangre procede

- del riesgo más o menos elevado de sufrir accidentes vasculares causados por ejemplo por una inestabilidad acrecentada de las placas de ateroma o, también,

- del riesgo más o menos elevado de dicho individuo afectado por un cáncer de sufrir una invasión metastásica o, también,

- del riesgo más o menos elevado de dicho individuo de sufrir un accidente vascular cerebral y sus consecuencias hemorrágicas o, también,

- del riesgo de este individuo de sufrir una trombosis.