Método para el diagnóstico y pronóstico de tolerancia en transplante de hígado empleando tejido hepático.

Método para el diagnóstico o pronóstico in vitro del estado de tolerancia de un paciente sometido a untrasplante hepático que comprende:

a. Medición, en una muestra biológica obtenida del aloinjerto hepático del paciente bajo investigación, delos niveles de expresión de al menos uno de los siguientes genes o combinaciones de los mismos:

TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2;

b. Evaluación de la tolerancia o no tolerancia del paciente bajo investigación al trasplante de hígadomediante la comparación del nivel de expresión de al menos uno de los genes o combinaciones de losmismos, del paso a), con el nivel de expresión de los mismos genes o combinaciones de los mismos,obtenido a partir de una muestra de referencia.

Método para el diagnóstico y pronóstico de tolerancia en trasplante de hígado empleando tejido hepático

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención hace referencia al campo de la medicina humana. Más específicamente, la presente invención se centraliza en un método para el diagnóstico in vitro o el pronóstico del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante de hígado, el cual comprende la medición de los niveles de expresión, in vitro, en muestras de tejido hepático, de al menos uno de los siguientes genes o combinaciones de los mismos: TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La supervivencia a largo plazo de los injertos trasplantados depende de forma crítica de la administración de larga duración de fármacos inmunosupresores para prevenir el rechazo del injerto. Estos fármacos son muy efectivos para la prevención del rechazo del injerto, pero están también asociados a graves efectos secundarios, como la nefrotoxicidad, y a un riesgo aumentado de infecciones oportunistas y tumores, y complicaciones metabólicas como la diabetes, la hiperlipidemia y la hipertensión arterial. Debido a los efectos secundarios de los fármacos inmunosupresores, la inducción de la tolerancia, definida como un estado en el que el injerto mantiene una función normal en ausencia de inmunosupresión crónica, es uno de los principales objetivos de la investigación en la inmunología del trasplante. La inducción de la tolerancia es posible en un gran número de modelos de trasplante en roedores. Sin embargo, la aplicación de estos tratamientos experimentales en la práctica clínica ha fallado en gran medida. Una de las razones por las que la aplicación clínica en humanos de tratamientos experimentales de inducción de la tolerancia no ha sido exitosa está relacionada con la falta de una herramienta precisa para el diagnóstico no invasivo de la inducción de la tolerancia en los receptores humanos del trasplante. Publicaciones recientes señalan la necesidad urgente de esta herramienta (N. Najafian et al 2006 y Newell et al. 2006) . Por otra parte, se ha detectado ocasionalmente el mantenimiento de la función normal del alotrasplante a pesar de la completa retirada de los fármacos inmunosupresores en trasplantes clínicos de órganos, particularmente después de un trasplante hepático. Los pacientes que espontáneamente aceptan los injertos se consideran convencionalmente como tolerantes “operacionales”, y proporcionan una prueba de que la tolerancia inmunológica puede conseguirse realmente en humanos. El trasplante de hígado es el único entorno clínico en el que la tolerancia ocurre espontáneamente en una proporción sustancial de pacientes. De hecho, la retirada completa de la inmunosupresión puede lograrse en alrededor del 21% de los pacientes (Lerut, J. et al 2006) . Desafortunadamente, no hay actualmente ningún medio para identificar estos pacientes antes de que se lleve a cabo la retirada de la inmunosupresión. Por esta razón, la completa retirada de los fármacos inmunosupresores raras veces se lleva a cabo en el trasplante de hígado, y así muchos pacientes continúan siendo innecesariamente inmunosuprimidos, con los problemas de salud y económicos que esto acarrea.

Algunos intentos anteriores para identificar la tolerancia en el trasplante, principalmente en receptores de riñón e hígado, han empleado bien ensayos funcionales antígeno-específicos o bien análisis no específicos de antígeno. En los ensayos funcionales, se prueban los linfocitos T del receptor con los antígenos del donante tanto in vitro como in vivo (J. Cai et al 2004) , (J. Cai et al 2004) y (E. Jankowska-Gan E et al 2002) , (P. Sagoo et al. 2010) . Estos ensayos son muy valiosos desde un punto de vista mecanístico, ya que son los únicos análisis capaces de revelar qué rutas son las responsables de la especificidad del estado de tolerancia. Desafortunadamente, estos ensayos son también muy difíciles de llevar a cabo, altamente variables de laboratorio a laboratorio (difíciles de estandarizar) , y requieren la disponibilidad de células del donante cuidadosamente criopreservadas. Por estos motivos, los ensayos funcionales no son óptimos para su aplicación clínica generalizada, y se emplean actualmente sólo en laboratorios seleccionados, altamente especializados, y básicamente para fines de investigación.

WO 2010/000320 A1 (INST INVEST S BIOMEDIQUESM, 7 Januar y 2010) divulga un método para el diagnóstico o pronóstico in vitro del estado de tolerancia de un paciente sometido al transplante de hígado, que comprende la medición de los niveles de expresión de un grupo de genes en una muestra y la determinación de la tolerancia o no tolerancia del paciente mediante la comparación del nivel de expresión con una muestra de referencia (de un paciente no tolerante al transplante de hígado) .

El análisis de monitorización inmune no específico de antígeno constituye una variedad de metodologías dirigidas a la caracterización fenotípica del sistema inmune del receptor, sin el uso de la inmunización con antígenos del donante. Entre estos análisis, se han empleado el estudio del receptor de las células T mediante los patrones de distribución de la longitud de CDR3 (TcLandscape) , el inmunofenotipaje de las células sanguíneas periféricas mediante citometría de flujo, y el perfil de expresión génica, para identificar biomarcadores característicos de la tolerancia en humanos. La técnica TcLandscape se ha empleado en sangre periférica para discriminar entre receptores de riñón tolerantes y receptores que experimentan rechazo crónico (S. Brouard et al. 2005) . Sin embargo, esta técnica es cara, actualmente sólo está disponible en un laboratorio (Inserm 643 y TcLand Expression en Nantes, Francia) , y nunca ha sido validada en trasplante de hígado. El uso del inmunofenotipaje de sangre periférica se ha utilizado con muestras de sangre periférica obtenidas de receptores tolerantes tanto de trasplante hígado como de riñón. Al menos son conocidos por los inventores cuatro estudios que abordan esta metodología. En el primero de ellos, de la Universidad de Pittsburgh en EE.UU. (G.V. Mazariegos et al 2003) , se dice que el ratio entre subgrupos de células dendríticas pDC y mDC podría distinguir entre receptores tolerantes y no tolerantes en trasplante pediátrico de hígado. En el segundo estudio, de Kyoto

(Y. Li et al 2004) , se dice que un ratio incrementado entre células T gamma/delta delta-1 y delta-2 en sangre periférica es más prevalente en receptores tolerantes de hígado que en los no tolerantes. En el tercer estudio, que fue coordinado por los inventores (Martínez-Llordella et al 2007) , se detectó en sangre periférica un número incrementado de células T CD4+CD25+ y un ratio incrementado de células T gamma/delta delta-1 a delta-2 en receptores de hígado tolerantes comparado con los receptores no tolerantes. El valor del ratio entre gamma/delta delta-1 y delta-2 ha sido sin embargo cuestionado en un estudio posterior del mismo grupo (Puig-Pey et al. Transplant Int 2010) . Además, ninguno de estos análisis ofrece la precisión requerida para una aplicación clínica generalizada. El uso de técnicas que obtienen el perfil de expresión génica para identificar biomarcadores de tolerancia se ha empleado tanto en trasplantes de riñón como de hígado (S. Brouard et al. PNAS 2007; M. Martínez-Llordella et al. J Clin Invest 2008; K.Newell et al. J Clin Invest 2010;

P. Sagoo et al. J Clin Invest 2010) . Estas técnicas son más fáciles de estandarizar que las pruebas descritas anteriormente. Además, los estudios referenciados han mostrado que el uso de los biomarcadores transcripcionales identificados es un medio extremadamente preciso para diferenciar entre receptores tolerantes sin fármacos inmunosupresores y receptores no tolerantes que requieren el mantenimiento de la inmunosupresión. La principal limitación de los estudios publicados en la literatura hasta el momento es que no han intentado validar prospectivamente sus resultados. En otras palabras, no han sido capaces de demostrar si estos marcadores pueden identificar receptores tolerantes antes de que se interrumpa la inmunosupresión. Ante la ausencia de esta demostración no es posible estar seguros de que las diferencias observadas en la expresión génica no están causadas realmente por el efecto de la inmunosupresión farmacológica en el grupo de los receptores no tolerantes. Además, ninguno de los estudios comentados anteriormente ha intentado investigar si las diferencias en la expresión génica también existen a nivel del injerto en sí.

Mientras que el uso crónico de fármacos inmunosupresores es actualmente el único medio para asegurar... [Seguir leyendo]

1. Método para el diagnóstico o pronóstico in vitro del estado de tolerancia de un paciente sometido a un trasplante hepático que comprende:

a. Medición, en una muestra biológica obtenida del aloinjerto hepático del paciente bajo investigación, de los niveles de expresión de al menos uno de los siguientes genes o combinaciones de los mismos: TFRC, CDHR2, HMOX1, MIF, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2;

b. Evaluación de la tolerancia o no tolerancia del paciente bajo investigación al trasplante de hígado mediante la comparación del nivel de expresión de al menos uno de los genes o combinaciones de los mismos, del paso a) , con el nivel de expresión de los mismos genes o combinaciones de los mismos, obtenido a partir de una muestra de referencia.

2. Método, según la reivindicación 1, donde la muestra de referencia es una muestra de ARN seleccionada entre: un conjunto de ARNs obtenido de un tejido hepático no trasplantado sano; un ARN de referencia disponible comercialmente; o un ARN de referencia absoluta que consiste en una muestra que contiene un número previamente cuantificado de moléculas de ARN.

3. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los genes TFRC y MIF están sobre-regulados, y los genes CDHR2, HMOX1, HAMP, IFNG, PEBP1, SLC5A12, ADORA3 y DAB2 están infraregulados, en receptores de trasplante hepático tolerantes comparado con el nivel de expresión de los mismos genes tomados de la muestra de referencia de ARN.

4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende la medición de los niveles de expresión de al menos una de las siguientes combinaciones de genes: LC5A12, VNN3, TFRC, SOCS1, MIF, TTC3, RBM23, PEBP1, SH2D1B, NCR1, DAB2 y ADORA3; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, HAMP, TUBA4A, TTC3, HMOX1, VNN3, NCR1, ADORA3, TAF15, IFNG, SOCS1 y TIPARP; MOX1, CDHR2, MIF, PEBP1, TFRC, SLC5A12, SOCS1, HAMP, VNN3 y IFNG; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, SLC5A12, HAMP, SOCS1, IFNG y HMOX1; TFRC, IFNG, CDHR2, ADORA3, HAMP, MIF, PEBP1, VNN3, SOCS1, HMOX1 y DAB2; TFRC, DAB2, MIF, PEBP1, IFNG, HAMP, SLC5A12, SOCS1, VNN3, ADORA3, CDHR2, MCOLN1 y HMOX1; TFRC, , IFNG, HMOX1, MCOLN1, MIF, HAMP, ADORA3, CDHR2, PEBP1 y SOCS1; EBP1, TFRC, HMOX1, IFNG, MCOLN1, SOCS1, MIF, CDHR2, HAMP y ADORA3; TFRC, PEBP1, IFNG, CDHR2, ADORA3, VNN3, HMOX1, DAB2, SOCS1, MIF y HAMP; DHR2, ADORA3, IFNG, TFRC, VNN3, HMOX1, PEBP1, MIF, SLC5A12, HAMP, SOCS1 y MCOLN1; LC5A12, TFRC, IFNG, MIF, DAB2, HMOX1, CDHR2, SOCS1, HAMP, PEBP1, VNN3, ADORA3 y MCOLN1; TFRC, SOCS1, HMOX1, PEBP1, VNN3, CDHR2, HAMP, IFNG, DAB2, MCOLN1, ADORA3 y MIF; TFRC, PEBP1, VNN3, SOCS1, MIF, HMOX1, DAB2, HAMP, IFNG, CDHR2, ADORA3 y MCOLN1; LC5A12, MIF, CDHR2, TFRC, IFNG, ADORA3, HAMP, VNN3, SOCS1, MCOLN1, PEBP1 y HMOX1; TFRC, IFNG, CDHR2, ADORA3, PEBP1, VNN3, MIF, HMOX1, MCOLN1, SOCS1, SLC5A12, DAB2 y HAMP; TFRC, VNN3, HAMP, CDHR2, SLC5A12, HMOX1, SOCS1, PEBP1 y MIF; AB2, TFRC, MIF, CDHR2, PEBP1, VNN3, TTC3, HMOX1 y SOCS1; TFRC, PEBP1, MIF, CDHR2, VNN3, IFNG, MCOLN1 y SOCS1; TFRC, PEBP1, MIF, SOCS1 y CDHR2.

5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde se miden los niveles de expresión de la combinación de genes que consiste en TFRC, IFNG y CDHR2.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que además comprende la determinación de al menos un parámetro adicional útil para el diagnóstico o pronóstico.

7. Método según la reivindicación 6 donde este parámetro adicional es el nivel sérico de Hepcidina.

8. Método según la reivindicación 6 donde este parámetro adicional es la edad y/o el tiempo tras el trasplante.

Figura 1 Figura 2 Figura 3

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Literatura no patente citada en la descripción