Método para determinar un régimen quimioterapéutico en base a la expresión ERCC1 y TS.

Un método para determinar un régimen quimioterapéutico que comprende 5-fluoroacilo,

oxaliplatino o unacombinación de los mismos para el tratamiento de un tumor en un paciente, que comprende:

(a) fijar una muestra tumoral y embeber la muestra fijada en parafina;

(b) aislar el ARNm de la muestra tumoral fijada embebida en parafina mediante el calentamiento de la muestra detejido en una solución que comprende una concentración eficaz de un compuesto caotrópico a una temperatura enel intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamentea aproximadamente 120 minutos recuperando dicho ARNm de dicha solución caotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos que hibridan en condicionesrigurosas a una región del gen ERCC1 y comprende la SEQ ID NO: 1 o un cebador oligonucleotídico idéntico almenos al 80% al mismo, y la SEQ ID NO: 2 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, y unpar de cebadores oligonucleotídicos que hidridan en condiciones rigurosas a una región del gen TS y comprende laSEQ ID NO: 3 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, y la SEQ ID NO: 4 o un cebadoroligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, para obtener una muestra amplificada de ERCC1 y unamuestra amplificada de TS;

(d) determinar la cantidad de ARNm de TS y ERCC1 en la muestra amplificada;

(e) comparar la cantidad de ARNm de TS y ERCC1 de la etapa (d) para una cantidad de ARNm de un gen de controlinterno; y

(f) determinar un régimen quimioterapéutico que comprende 5-fluorouracilo, oxaliplatino, o una combinación de losmismos, en base a la cantidad de ARNm de TS y/o ERCC1 en la muestra amplificada y el nivel de umbral para laexpresión del gen TS y/o ERCC1.

Método para determinar un régimen quimioterapéutico en base a la expresión ERCC1 y TS

Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos de pronóstico que son útiles en medicina, especialmente en la quimioterapia contra el cáncer. Más particularmente, la invención se refiere a la evaluación de la expresión génica de células tumorales en un paciente. La resistencia de las células tumorales a los agentes quimioterapéuticos citotóxicos, especialmente los antimetabolitos y agentes que dañan el ADN a la manera de los agentes de platinación se ensaya examinando el ARNm expresado de genes implicados en la síntesis nucleotídica y la reparación del ADN en humanos.

Antecedentes de la invención El cáncer surge cuando una célula normal experimenta una transformación neoplásica y se convierte en una célula maligna. Las células transformadas (malignas) escapan a los controles fisiológicos normales que especifican el fenotipo celular y restringen la proliferación celular. Por lo tanto, las células transformadas en el cuerpo de un individuo proliferan, formando un tumor. Cuando se encuentra un tumor, el objetivo clínico es destruir las células malignas de modo selectivo mitigando al mismo tiempo cualquier daño que puedan haber causado a las células normales del individuo sometido a tratamiento.

La quimioterapia se basa en el uso de fármacos que son tóxicos selectivamente (citotóxicos) para las células cancerosas. Se han desarrollado varias clases generales de fármacos quimioterapéuticos, incluyendo fármacos que interfieren con la síntesis de ácidos nucleicos, la síntesis de proteínas, y otros procesos metabólicos vitales. Generalmente estos se denominan fármacos antimetabolitos. Otras clases de fármacos quimioterapéuticos ocasionan daño al ADN celular. Los fármacos de estas clases generalmente se denominan genotóxicos.

Sin embargo, a menudo sólo se puede evaluar con precisión la susceptibilidad de un neoplasma individual a un determinado fármaco quimioterapéutico, o combinación de fármacos, después de un período de prueba del tratamiento. El tiempo invertido en un período de prueba infructuoso tiene un riesgo significativo en el control clínico de los cánceres agresivos.

La reparación del daño al ADN celular es un importante proceso biológico realizado por una maquinaria enzimática de reparación del ADN de una célula. Las lesiones sin reparar en el genoma de una célula pueden impedir la replicación del ADN, afecta a la fidelidad de la replicación del ADN recién sintetizado y/o obstaculizar la expresión de genes necesarios para la supervivencia celular. Por lo tanto, los fármacos citotóxicos generalmente se consideran más tóxicos para las células que se están dividiendo activamente que intervienen en la síntesis del ADN que para las células inactivas no divisoras. Sin embargo, las células normales de muchos tejidos corporales están inactivas y pocas veces su consigna es introducirse de nuevo en ciclo celular y dividirse. Se proporciona más tiempo entre las rondas de división celular para la reparación del daño del ADN de las células normales causado por genotoxinas quimioterapéuticas. Como resultado, se obtiene cierta selectividad para la destrucción de células cancerosas. Muchos regímenes de tratamiento reflejan los intentos por mejorar la selectividad de las células cancerosas mediante la administración conjunta de fármacos quimioterapéuticos que pertenecen a dos o más de estas clases 45 generales.

Dado que la quimioterapia eficaz en tumores sólidos con frecuencia requiere una combinación de agentes, la identificación y cuantificación de los determinantes de la resistencia o sensibilidad a cada fármaco individual se ha convertido en una herramienta importante para diseñar la quimioterapia de combinación individual.

Los fármacos anticancerosos genotóxicos usados ampliamente que han demostrado dañar el ADN celular son cisplatino (DDP) y carboplatino. Actualmente, el cisplatino y/o el carboplatino use usan en el tratamiento de neoplasias diversas seleccionadas de origen epitelial y mesenquimal, incluyendo carcinomas y sarcomas del tracto respiratorio, gastrointestinal y reproductor, del sistema nervioso central y de origen escamoso en la cabeza y el

cuello. Actualmente, se prefiere el cisplatino en combinación con otros agentes para el control del carcinoma testicular y, en muchos casos, produce una remisión duradera (Loehrer y col., 1984, 100 Ann. Int. Med. 704) . El cisplatino (DDP) altera la estructura del ADN a través de la formación de aductos intracatenarios. La resistencia a los agentes de platino, tales como DDP, se ha atribuido a una mejor tolerancia a los aductos de platino, un descenso de la acumulación de fármacos y a una mejor reparación del ADN.

El oxaliplatino, otro agente quimioterapéutico a base de platino que lleva un anillo de 1, 2-diaminociclohexano ha demostrado eficacia anticancerosa in vitro e in vivo. Se considera que este voluminoso grupo vehículo lleva a los aductos de platino-ADN, que son más citotóxicos que los aductos formados a partir de otros agentes de platino y más eficaces en el bloqueo de la replicación del ADN. Los últimos datos han demostrado que la deficiencia en el 65 sistema de reparación de desemparejamientos (MMR) , así como el aumento de la capacidad del complejo de replicación para sintetizara ADN más allá del sitio de daño del ADN (mejora de la derivación de replicación) causa la resistencia al cisplatino, pero no al oxaliplatino (Raymond y col., Semin Oncol 25, Supl. 5: 4-12, 1998) .

La reparación por escisión de aductos voluminosos de ADN, tales como los formados por los agentes de platino, parece ser mediada por genes implicados en el reconocimiento y escisión del daño del ADN. Cleaver y col.,

Carcinogenesis 11: 875-882 (1990) ; Hoeijmakers y col., Cancer Cells 2: 311-320 (1990) ; Shivji y col., Cell 69: 367374 (1992) . En efecto, las células que tienen un defecto genético en uno o más elementos de la maquinaria enzimática de reparación del ADN son sumamente sensibles al cisplatino. Fraval y col. (1978) , 51 Mutat. Res. 121, Becky Brubaker (1973) , 116 J. Bacteriol. 1247.

El gen de complementación cruzada para la reparación por escisión (ERCC1) es esencial en la reparación de los aductos de ADN. Se ha clonado el gen ERCC1 humano. Westerveld y col., Nature (Londres) 310: 425-428 (1984) ; Tanaka y col., Nature 348: 73-76 (1990) ; (Nº de acceso XM_009432, SEQ ID NO: 10) . Varios estudios que usan líneas celulares mutantes humanas y de hámster, que son defectuosas en este gen, y los estudios en tejidos tumorales humanos, indican que el producto codificado por ERCC1 está implicado en la reparación por escisión de los aductos de platino-ADN. Dabholkar y col., J. Natl. Cancer Inst. 84: 1512-1517 (1992) ; Dijt y col., Cancer Res. 48: 6058-6062 (1988) ; Hansson y col., Nucleic Acids Res. 18: 35-40 (1990) .

Cuando se transfiere a células CHO deficientes para la reparación del ADN, el ERCC1 confiere resistencia celular a la quimioterapia a base de platino por su capacidad para reparar los aductos de platino-ADN. Hansson y col., Nucleic Acids Res. 18: 35-40 (1990) . Los modelos de reparación por escisión aceptados en la actualidad sugieren que la etapa de reconocimiento de daño/escisión es limitante, en cuanto a la velocidad, para el proceso de reparación por escisión.

Se han examinado los niveles relativos de expresión de los genes de reparación por escisión, tales como ERCC1,

en células malignas de pacientes cancerosos que reciben terapia a base de platino. Dabholkar y col., J. Natl. Cancer Inst. 84: 1512-1517 (1992) . Se ha indicado que la sobreexpresión de ERCC1 en pacientes de cáncer gástrico tiene un impacto negativo sobre la respuesta tumoral y la supervivencia final cuando se trata con el régimen quimioterapéutico combinado a base de platino y a base de antimetabolitos (cisplatino/fluorouracilo) , (Metzger y col., J Clin Oncol 16: 309, 1998) . Por lo tanto, los niveles intratumorales de expresión de ERCC1 pueden constituir un importante factor pronóstico para determinar si una quimioterapia a base de platino, sola o en combinación con una terapia con antimetabolitos, sería eficaz o no en el tratamiento de pacientes con cáncer.

Los compuestos quimioterapéuticos citotóxicos antimetabólicos incluyen fármacos que interfieren con la síntesis de ácidos nucleicos, la síntesis de proteínas y otros procesos metabólicos vitales. Por ejemplo, el 5-fluorouracilo (5-FU) 35 es un fármaco de uso muy generalizado para el tratamiento de numerosos tipos de cánceres diferentes, incluyendo los principales cánceres, tales como, por ejemplo, los del tracto Gl y de mama (Moertel,... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar un régimen quimioterapéutico que comprende 5-fluoroacilo, oxaliplatino o una combinación de los mismos para el tratamiento de un tumor en un paciente, que comprende: 5

(a) fijar una muestra tumoral y embeber la muestra fijada en parafina;

(b) aislar el ARNm de la muestra tumoral fijada embebida en parafina mediante el calentamiento de la muestra de tejido en una solución que comprende una concentración eficaz de un compuesto caotrópico a una temperatura en

el intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 ºC durante un periodo de tiempo de aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos recuperando dicho ARNm de dicha solución caotrópica;

(c) someter el ARNm a amplificación usando un par de cebadores oligonucleotídicos que hibridan en condiciones rigurosas a una región del gen ERCC1 y comprende la SEQ ID NO: 1 o un cebador oligonucleotídico idéntico al

menos al 80% al mismo, y la SEQ ID NO: 2 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, y un par de cebadores oligonucleotídicos que hidridan en condiciones rigurosas a una región del gen TS y comprende la SEQ ID NO: 3 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, y la SEQ ID NO: 4 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, para obtener una muestra amplificada de ERCC1 y una muestra amplificada de TS;

(d) determinar la cantidad de ARNm de TS y ERCC1 en la muestra amplificada;

(e) comparar la cantidad de ARNm de TS y ERCC1 de la etapa (d) para una cantidad de ARNm de un gen de control

interno; y 25

(f) determinar un régimen quimioterapéutico que comprende 5-fluorouracilo, oxaliplatino, o una combinación de los mismos, en base a la cantidad de ARNm de TS y/o ERCC1 en la muestra amplificada y el nivel de umbral para la expresión del gen TS y/o ERCC1.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el tumor es un tumor de adenocarcinoma colorrectal.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de umbral de la expresión del gen ERCC1 es aproximadamente 4, 9 x 10-3 veces el nivel de expresión de un gen de control interno.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de umbral de la expresión del gen TS es aproximadamente 7, 5 x 10-3 veces el nivel de expresión de un gen de control interno.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el gen de control interno es β-actina.

6. Un kit para detectar la expresión de un gen TS que comprende un par de cebadores oligonucleotídicos que consiste en la SEQ ID NO: 3 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, y la SEQ ID NO: 4 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo.

7. Un kit para detectar la expresión de los genes TS y ERCC1 que comprende (a) un par de cebadores 45 oligonucleotídicos que consiste en la SEQ ID NO: 3 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, y la SEQ ID NO: 4 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo, y (b) un par de cebadores oligonucleotídicos que consiste en la SEQ ID NO: 1 o un oligonucleótido idéntico al menos al 80% al mismo, y la SEQ ID NO: 2 o un cebador oligonucleotídico idéntico al menos al 80% al mismo.