Método in vitro de obtención de fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C.

Método de obtención de fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C,

que comprende una etapa puesta en contacto in vitro de fibroblastos intrahepáticos con partículas infecciosas del virus de la hepatitis C.

Método in vitro de obtención de fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C.

El virus de la hepatitis C es un virus con envoltura con un genoma RNA monocatenario y polaridad positiva. Pertenece al género Hepacivirus, del cual es el único miembro, y forma parte de la familia Flaviviridae. La replicación del RNA genómico pasa a través de una cadena anti-genómica de polaridad negativa, que servirá a su vez como matriz para la síntesis de los ARN genómicos. Los ARN genómicos neosintetizados servirán, o bien para la síntesis de una poliproteína escindida de forma co- y post-traduccional por proteasas celulares y virales con el fin de producir las proteínas virales estructurales y no estructurales, o bien para la síntesis de nuevas cadenas de ARN de polaridad negativa, o bien se encapsidarán tras la oligomerización de la proteína capsidial. Las nucleocápsides formadas en el citoplasma adquieren su envoltura por gemación a nivel del retículo endoplasmático donde quedan retenidas las glicoproteínas E1 y E2, y a continuación se liberan las partículas virales en el medio exterior.

La infección por este virus representa un importante problema de salud pública debido a la alta prevalencia de la infección y al importante riesgo de evolución hacia una hepatitis crónica, estimado entre un 50 y un 80 %. En efecto, el virus de la hepatitis C (VHC) infecta aproximadamente al 3 % de la población y es responsable de aproximadamente 170 millones de infecciones crónicas. La infección crónica conduce de forma progresiva a una hepatitis fibrosa que puede evolucionar a una cirrosis y a un carcinoma hepatocelular.

Actualmente, el tratamiento antiviral más eficaz consiste en un tratamiento combinado que se basa en el uso conjunto de interferón alfa pegilado y de un análogo nucleosídico, la ribavirina. Sin embargo, este tratamiento solo es eficaz en aproximadamente el 50 % de los pacientes tratados y, por otra parte, es mal tolerado por numerosos pacientes.

La lucha contra el virus de la hepatitis C sigue siendo, por lo tanto, un importante problema de salud pública, y resulta imperativo desarrollar nuevas moléculas dirigidas al ciclo viral, o que puedan interrumpir, e incluso impedir, que se produzcan fibrosis provocadas tras la infección por el VHC.

La fibrosis hepática es la complicación común de las enfermedades crónicas del hígado, y en particular de la hepatitis viral C. Se caracteriza por la acumulación de matriz extracelular (MEC) compuesta principalmente por colágenos de tipo I, III, IV y V. Durante la fibrogénesis hepática, las células hepáticas estrelladas (o « HSC » por « hepatic stellate cell ») y los fibroblastos intrahepáticos (FIH) se activan o se transdiferencian en miofibroblastos hepáticos que adquieren la capacidad de expresar la alfa-SMA (« smooth muscle alpha-actin ») , los cuales producen matriz extracelular (MEC) e inhiben la degradación de esta última degradando las metaloproteasas.

El mecanismo de las lesiones hepáticas inducidas durante la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) no se conoce bien y el vínculo entre infección de los hepatocitos por este virus y la activación de la fibrogénesis sigue siendo una hipótesis. Se ha propuesto en particular que la inflamación crónica, que es resultado de la infección de los hepatocitos por el VHC, produciría un estímulo que induciría la activación de los fibroblastos intrahepáticos (FIH) . De acuerdo con esta hipótesis, las citocinas liberadas por los hepatocitos infectados por el VHC, las células endoteliales, las células de Kupffer o los linfocitos infiltrados podrían ser responsables de la activación (Friedman S. L., J. Biol. Chem., 275, págs. 2.247-2.250, 2000; Schulze-Krebs y otros, Gastroenterology, 129 (1) , págs. 246-258, 2005) .

Con el fin de desarrollar antivirales que se dirijan de forma eficaz a la fibrosis inducida durante la infección por el VHC, es necesario aclarar los mecanismos que están en el origen de esta fibrosis inducida por el virus.

Los inventores han descubierto ahora que el VHC puedeinfectar in vivo los fibroblastos intrahepáticos (FIH) y activarlos, lo que sugiere firmemente que los hepatocitos podrían desempeñar una función de depósito del virus, pero que la fibrosis se debería esencialmente a la infección de los fibroblastos. Este descubrimiento es sorprendente ya que, hasta ahora, se sabía que el VHC solo infectaba a los hepatocitos, monocitos, linfocitos y a algunas células secretoras (Shimizu y col., Hepatology, 23, págs. 205-209, 1996; Wong y col., J. Virol., 75, págs. 1.229-1.235, 2001; Caussin-Schwemling y col., J. med. Virol., 65, págs. 14-22, 2001; Arrieta y col., Am. J. Pathol., 158, págs. 259-264, 2001; Steffan y col., Microb. Infect. 3, págs. 193-202, 2001; Bartolomé y col., J. Med. Virol. 80, págs. 1.588-1.594, 2008) . Ningún dato sugería que los fibroblastos intrahepáticos fuesen sensibles y permisibles a la infección por el VHC.

De este modo, un primer objeto de la presente invención se refiere a un método de obtención de fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C que comprende una etapa de aislamiento de los fibroblastos intrahepáticos a partir de un tejido hepático proveniente de un paciente VHC-positivo.

Se entiende por « paciente VHC-positivo » cualquier persona que, al extraerle tejido hepático, está infectada por el VHC. Puede tratarse, en particular, de un paciente afectado por una hepatitis C crónica.

Los fibroblastos intrahepáticos se pueden aislar mediante diferentes métodos conocidos en sí mismos, por ejemplo el que describen Tiggelman MBC y col. (J. Hepatol., 23, págs. 307-317, 1995) o el que describen Win K. M. y col. (Hepatology, 18, págs. 137-145, 1993) . Estas células pueden caracterizarse y diferenciarse fácilmente de otros tipos de células, en particular mediante el método descrito por Aoudjehane y col (Lab. Invest., 88, págs. 973-985, 2008) . Por otra parte, al ser los fibroblastos intrahepáticos células activadas que expresan la alfa-SMA y la vimentina, estos marcadores permiten caracterizarlos, en asociación con la presencia de la molécula de superficie CD90 y la ausencia de la molécula CD31.

Los inventores también han constatado que los fibroblastos intrahepáticos podían infectarse in vitro por el VHC. Por lo tanto, la invención también tiene por objeto otro método de obtención de fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C que comprende una etapa de puesta en contacto in vitro de fibroblastos intrahepáticos con partículas infecciosas del virus de la hepatitis C. Las reservas de partículas virales infecciosas pueden provenir de sueros de pacientes o de cultivo in vitro del virus. En este último caso, las partículas infecciosas pueden ser en particular las partículas VHC-JFH1 producidas al transfectar el RNA genómico transcrito a partir del plásmido pJFH-1 en células Huh-7.5 (Wakita y col., Nat. Med., 11, págs. 791-796, 2005) . También se pueden utilizar otras partículas infecciosas distintas del VHC-JFH1, que expresan genotipos diferentes o genotipos quiméricos, en particular las que describen Gottwein y col., (Gastroenterology, 133, págs. 1.614-1.626, 2007) y Pietschmann y otros (P.N.A.S., 103, págs. 7.408-7.413, 2006) .

Los fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C, en particular los que se obtienen mediante los métodos descritos con anterioridad, también forman parte de la presente invención. Por «fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C», se entiende, no solo los fibroblastos intrahepáticos infectados tras la fijación del virus a la célula y la penetración de la partícula viral en la célula, sino también cualquier célula que comprenda el ARN genómico (cadena de polaridad positiva) y/o el ARN anti-sentido (cadena de polaridad negativa) del VHC, o cualquier otro ARN que comprenda todo o parte del ARN genómico del VHC y que conserve la capacidad de replicarse en la célula, por ejemplo los replicones bicistrónicos descritos por Lohmann y col., (Science, 285, págs. 110-113, 1999) .

Otro objeto de la presente invención se refiere a un método de replicación in vitro del genoma del virus de la hepatitis C que comprende una etapa de cultivo in vitro de fibroblastos intrahepáticos aislados infectados por el virus de la hepatitis C. De manera ventajosa, los fibroblastos intrahepáticos aislados infectados se obtienen por medio de los métodos de acuerdo con la invención definidos con anterioridad. Las condiciones óptimas de cultivo las puede determinar fácilmente el experto en la materia mediante trabajos rutinarios.

Por otra parte, al infectarse los fibroblastos intrahepáticos... [Seguir leyendo]

1. Método de obtención de fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C, que comprende una etapa puesta en contacto in vitro de fibroblastos intrahepáticos con partículas infecciosas del virus de la hepatitis C.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de la hepatitis C es el VHC-JFH1.

3. Método de obtención de fibroblastos intrahepáticos infectados por el virus de la hepatitis C, que comprende una etapa de aislamiento de fibroblastos intrahepáticos a partir de una muestra de un tejido hepático previamente extraído de un paciente VHC-positivo.

4. Fibroblasto intrahepático aislado infectado por un virus de la hepatitis C, o que comprende el genoma de un virus de la hepatitis C o un replicón del mismo, que se puede obtener mediante uno cualquiera de los métodos definidos en las reivindicaciones 1 a 3.

5. Procedimiento de replicación in vitro del genoma del virus de la hepatitis C, caracterizado porque comprende una etapa de cultivo in vitro de fibroblastos intrahepáticos aislados infectados por el virus de la hepatitis C.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que los fibroblastos intrahepáticos aislados infectados por el virus de la hepatitis C se obtienen mediante uno cualquiera de los métodos definidos en las reivindicaciones 1 a 3.

7. Método de selección de moléculas contra el VHC que comprende las siguientes etapas:

-poner en contacto fibroblastos intrahepáticos infectados por un virus de la hepatitis C o fibroblastos intrahepáticos que comprenden el genoma de un virus de la hepatitis C o un replicón del mismo, con la molécula a ensayar;

-medirla replicación del genoma del VHC y/o la producción de partículas del VHC.

8. Método de selección de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la etapa de medición de la replicación del genoma del VHC se realiza mediante la cuantificación de la cadena de ARN de polaridad positiva y/o de la cadena de ARN de polaridad negativa del VHC.

9. Método de selección de moléculas antifibrogénesis que comprende las siguientes etapas:

-poner en contacto fibroblastos intrahepáticos infectados por un virus de la hepatitis C o fibroblastos intrahepáticos que comprenden el genoma de un virus de la hepatitis C o un replicón del mismo, con la molécula e ensayar;

-medir la expresión de al menos un gen implicado en la fibrosis.

10. Método de selección de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el gen o los genes implicados en la fibrosis, cuya expresión se mide, se selecciona entre los genes de los colágenos de tipo I, III, IV y V.

11. Método de evaluación de la toxicidad de una molécula con respecto a los fibroblastos hepáticos de un paciente afectado por hepatitis C que comprende las siguientes etapas:

-poner en contacto fibroblastos intrahepáticos infectados por un virus de la hepatitis C o fibroblastos intrahepáticos que comprenden el genoma de un virus de la hepatitis C o un replicón del mismo con la molécula a ensayar;

-evaluar la mortalidad de dichos fibroblastos intrahepáticos.