Células troncales vasculares y sus utilizaciones.

Método para obtener una población celular enriquecida en células troncales vasculares,

que comprende:

a) proporcionar una muestra aislada de la túnica media y de la túnica interna de una arteria de mamífero;

b) digerir enzimáticamente la muestra de la etapa a) para liberar las células vasculares;

c) combinar las células vasculares obtenidas en la etapa (b) con un sustrato vital y/o lipófilo marcado para lostransportadores de casete de unión a ATP, en condiciones apropiadas para la captación del sustrato pordichas células;

d) determinar la cantidad de sustrato marcado presente en cada célula; y

e) aislar la población de células nucleadas que contiene la cantidad más baja de sustrato, obteniendo así unapoblación celular enriquecida en células troncales vasculares.

Células troncales vasculares y sus utilizaciones.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para obtener una población celular enriquecida en células troncales vasculares, y a las células troncales vasculares obtenidas a partir de este método. Estas células troncales vasculares se pueden usar para una variedad de fines, especialmente en terapia celular para el tratamiento de enfermedades isquémicas, incluyendo isquemia periférica e infarto de miocardio.

Antecedentes de la invención La isquemia se refiere a un suministro insuficiente de sangre a cualquier parte del cuerpo. La causa más habitual de isquemia en el músculo cardíaco es debida a arteriopatía coronaria, que es un bloqueo de las arterias que evita que la sangre rica en oxígeno alcance el corazón. Si se interrumpe el flujo sanguíneo en el corazón, se produce un ataque cardíaco.

Los pacientes con arteriopatía coronaria avanzada tienen síntomas debilitantes tales como angina, pérdida de la respiración, fatiga, sudoración y náusea. En pacientes con arteriopatía coronaria acoplada a isquemia grave, se debe de realizar algún tipo de intervención para mantener la vida de estos pacientes.

Además del corazón, la isquemia también se puede producir en los músculos esqueléticos a partir de lesiones traumáticas a diversas arterias, y generalmente se conoce como isquemia periférica. En este caso, existe la posibilidad de amputar un miembro si la isquemia grave no se trata apropiadamente.

La intervención quirúrgica para tratar la isquemia es un método conocido y practicado. Por ejemplo, el tratamiento de cardiopatía isquémica con cirugía de baipás de la arteria coronaria o angioplastia puede reducir, en la mayoría de los casos, los síntomas de esta enfermedad y prolongar la vida de estos pacientes.

Como alternativa a la intervención quirúrgica, se han buscado técnicas angiogénicas naturales. Estas técnicas se basan en la capacidad del cuerpo para generar nuevos vasos sanguíneos al poner en marcha la angiogénesis con factores de crecimiento tales como FGF-1, VEGF e IGF. Además, en el caso de infarto de miocardio, se están explorando estudios que usan mioblastos esqueléticos autólogos que son transplantados en miocardio dañado por isquemia.

El problema con las técnicas anteriores es que a menudo dan como resultado una revascularización incompleta debido a la presencia de isquemia que se extiende en pequeños vasos periféricos. Además, si se produce la revascularización, a menudo es un proceso tan lento para restaurar completamente la función orgánica.

La revascularización rápida de órganos lesionados, isquémicos y en regeneración es esencial para restaurar la función orgánica. De este modo, actualmente se está realizando mucho esfuerzo científico para suministrar células progenitoras vasculares para facilitar la restauración de la revascularización orgánica para tratar la isquemia, así como otras enfermedades. Varios estudios han mostrado que las células derivadas de la médula ósea o células que circulan en la sangre periférica contribuyen funcionalmente a neoangiogénesis durante la curación de heridas y la isquemia de extremidades e infarto posmiocárdico (véase, por ejemplo, Rafii, S., Lynden, D., Nat. Med. 6, 702-712, 2003) .

El uso de progenitores de células endoteliales derivados de células troncales hematopoyéticas para potenciar la angiogénesis se describe, por ejemplo, en la patente US no 5.980.887.

A pesar del entusiasmo por estos ensayos clínicos pioneros, todavía está por determinar en ensayos clínicos aleatorizados si estas estrategias terapéuticas darán como resultado una mejora duradera de la revascularización y una morbimortalidad reducida sin toxicidad a largo plazo. La toxicidad de comienzo tardío puede surgir como resultado del uso de poblaciones completas de células mononucleares de médula ósea, que contienen diferentes células troncales, progenitoras y hematopoyéticas específicas de órganos. Esto es de importancia crítica, puesto que la introducción de células no esenciales en órganos puede estar asociada con una mayor toxicidad. Puesto que las células hematopoyéticas pueden producir, por ejemplo, cantidades profibróticas y excesivas de factores angiogénicos, la introducción innecesaria de estas células en mamíferos puede inducir la formación de edema y vasos con tendencia a hemorragia dilatada. Además, si se incorporan en miocardio que se regenera, estas células no esenciales pueden dar como resultado la generación de tejidos no cardíacos o no vasculares y arritmias peligrosas para la vida. De este modo, son necesarios procedimientos de aislamiento más complejos para obtener poblaciones puras de células troncales y/o progenitoras vasculares para evitar futuras complicaciones y contratiempos clínicos potenciales que pueden detener ensayos futuros y disminuir el valor verdadero de la terapéutica con células troncales vasculares.

La solicitud de patente US 20030194802 proporciona un método para aislar células progenitoras vasculares a partir de células troncales embriónicas. Sin embargo, con vista a las aplicaciones clínicas, el uso de células troncales embriónicas plantea una variedad de problemas éticos e inmunológicos, con respecto al suministro de células.

De este modo, todavía existe la necesidad en esta técnica de proporcionar un método para aislar una población celular enriquecida en células troncales vasculares procedentes de células adultas.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para obtener una población celular enriquecida en células troncales vasculares, proporcionando dicho método células troncales vasculares más puras que aquellas conocidas en la técnica.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una población celular, enriquecida en células troncales vasculares, obtenible mediante este método.

También un objetivo de la presente invención consiste en utilizar células troncales vasculares enriquecidas para la preparación de un producto de terapia celular para tratar enfermedades asociadas con isquemia.

También un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un kit que contiene la población celular de la presente invención y una biomatriz, así como una composición que contiene las células troncales vasculares de la presente invención y un vehículo fisiológicamente aceptable.

Estos y otros objetivos se logran mediante la presente invención como se evidencia por el sumario de la invención, la descripción de las formas de realización preferidas y las reivindicaciones.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a dos poblaciones de células arteriales aisladas de arteria de mamífero: células de población lateral (SP) y células de población principal (MP) . Las células SP también se denominan en la presente memoria población celular enriquecida en células troncales vasculares.

La presente invención proporciona así un método para obtener una población celular enriquecida en células troncales vasculares, que comprende a) proporcionar una muestra aislada de la túnica media y de la túnica interna de una arteria de mamífero; b) digerir enzimáticamente la muestra de la etapa a) para liberar las células vasculares; c) combinar las células vasculares obtenidas en la etapa (b) con un sustrato vital y/o lipófilo marcado para transportadores de casete de unión a ATP, en condiciones apropiadas para la captación del sustrato por dichas células; d) determinar la cantidad de sustrato marcado presente en cada célula; y e) aislar la población de células nucleadas que contiene la cantidad más baja de sustrato, obteniendo de ese modo una población celular enriquecida en células troncales vasculares. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para obtener una población celular enriquecida en células troncales vasculares, que comprende a) proporcionar una muestra aislada de la túnica media y de la túnica interna de una arteria de mamífero; b) digerir enzimáticamente la muestra de la etapa a) para liberar células vasculares; y c) seleccionar las células vasculares obtenidas de la etapa b) que expresan un transportador Bcrp1/ABCG2.

En todavía otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar tejido vascular, que comprende cultivar una población celular enriquecida en células troncales vasculares según la invención, en presencia de al menos un factor de crecimiento vasculogénico y/o angiogénico, en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación del tejido vascular, obteniendo de ese modo tejido vascular.

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1. Método para obtener una población celular enriquecida en células troncales vasculares, que comprende:

a) proporcionar una muestra aislada de la túnica media y de la túnica interna de una arteria de mamífero;

b) digerir enzimáticamente la muestra de la etapa a) para liberar las células vasculares;

c) combinar las células vasculares obtenidas en la etapa (b) con un sustrato vital y/o lipófilo marcado para los 10 transportadores de casete de unión a ATP, en condiciones apropiadas para la captación del sustrato por dichas células;

d) determinar la cantidad de sustrato marcado presente en cada célula; y

e) aislar la población de células nucleadas que contiene la cantidad más baja de sustrato, obteniendo así una población celular enriquecida en células troncales vasculares.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho sustrato marcado para los transportadores de casete de unión a ATP es un colorante fluorescente vital. 20

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha etapa d) se lleva a cabo exponiendo las células a una longitud de onda de excitación que provoca la fluorescencia del colorante, y determinando la emisión de fluorescencia de cada célula.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho colorante es el colorante Hoechst 33342, dicha longitud de onda de excitación es de 351 nm, y se determina para cada célula una longitud de onda de emisión de 400 a 700 nm.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que las etapas d) y e) se llevan a cabo usando un 30 dispositivo FACS.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que, además del sustrato marcado, se añade un colorante que permite la exclusión de células muertas.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicho colorante que permite la exclusión de las células muertas es el yoduro de propidio.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células proporcionadas en la etapa a) se aíslan de una arteria humana. 40

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha muestra se digiere con colagenasa o colagenasas tipo II.

10. Utilización de un anticuerpo provocado contra Bcrp1/ABCG2 para detectar y/o purificar las células troncales 45 vasculares a partir de células arteriales de mamífero.

11. Utilización según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal provocado contra un transportador Bcrp1/ABCG2.

12. Utilización según la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal provocado contra un transportador Bcrp1/ABCG2.

13. Método para obtener una población celular enriquecida en células troncales vasculares, que comprende:

a) proporcionar una muestra aislada de la túnica media y de la túnica interna de una arteria de mamífero;

b) digerir enzimáticamente la muestra de la etapa a) para liberar las células vasculares; y

c) seleccionar las células vasculares obtenidas de la etapa b) que expresan un transportador Bcrp1/ABCG2.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la etapa c) se lleva a cabo mediante clasificación FACS. 60

15. Población celular enriquecida en células troncales vasculares obtenible mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

16. Población celular según la reivindicación 15, que es una población celular humana enriquecida en células 65 troncales vasculares.

17. Población celular enriquecida en células troncales vasculares, caracterizada porque es obtenible mediante el método según las reivindicaciones 13 o 14.

18. Método para preparar tejido vascular, que comprende cultivar una población celular enriquecida en células troncales vasculares según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en presencia de al menos un factor de crecimiento vasculogénico y/o angiogénico, en condiciones adecuadas para inducir la diferenciación del tejido vascular, obteniendo así un tejido vascular.

19. Método según la reivindicación 18, que comprende además una o más fases de expansión tras la diferenciación de dicho tejido vascular.

20. Método según la reivindicación 18, en el que dicha etapa de cultivo se lleva a cabo en un medio semisólido promotor de la vascularización que comprende componentes de la matriz extracelular.

21. Método según la reivindicación 20, en el que dicho componente de la matriz extracelular es una membrana basal Matrigel o un gel de colágeno.

22. Método según la reivindicación 20 o 21, en el que dicho medio comprende VEGF y uno o más compuestos seleccionados entre el grupo de suero fetal bovino, hidrocortisona, hFGF-B, R3-IGF-1, ácido ascórbico, hEGF, GA1000 y heparina.

23. Método para preparar un tejido de mamífero regenerado vascularizado, que comprende:

a) proporcionar una población celular enriquecida en células troncales vasculares según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17; y

b) poner en contacto dicha población celular con un tejido de mamífero aislado en condiciones adecuadas para la diferenciación de las células troncales vasculares en células vasculares, obteniendo así un tejido de mamífero regenerado vascularizado.

24. Método según la reivindicación 23, en el que el tejido de mamífero aislado consiste en cultivos celulares in vitro seleccionados entre hepatocitos, células epidérmicas y dérmicas, células pancreáticas, tejido del músculo esquelético, tejido del músculo liso, tejido miocárdico, tejido adiposo, cartilaginoso y óseo, y en el que el cultivo celular se cocultiva con dicha población celular enriquecida en células troncales vasculares.

25. Método según la reivindicación 24, en el que dicho cocultivo se lleva a cabo sobre una matriz 3D o sobre un armazón semiporoso.

26. Método para obtener un producto de terapia celular, que comprende

a) proporcionar una composición celular seleccionada del grupo de:

i. una población celular enriquecida en células troncales vasculares según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17;

ii. un tejido vascular como se prepara según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22; y

iii. un tejido regenerado vascularizado como se prepara según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25;

b) combinar una cantidad eficiente de dicha composición celular con un vehículo apropiado para la administración in vivo en un mamífero obteniendo así un producto de terapia celular.

27. Utilización de la población celular enriquecida en células troncales vasculares según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, para la preparación de un producto de terapia celular destinado al tratamiento en un mamífero de insuficiencia cardíaca posisquémica o cardiovasculopatía.

28. Utilización según la reivindicación 27, en el que dicho mamífero es un ser humano que sufre insuficiencia cardíaca posisquémica o cardiovasculopatía.

29. Utilización según la reivindicación 27, en el que dicha población celular enriquecida en células troncales vasculares se aísla de una arteria de dicho ser humano que sufre insuficiencia cardíaca posisquémica o cardiovasculopatía.

30. Utilización de la población celular enriquecida en células troncales vasculares según cualquiera de las

reivindicaciones 15 a 17, para el cribado in vitro de compuestos angiogénicos o antiangiogénicos.

31. Método in vitro para el cribado de compuestos que presentan un compuesto angiogénico o antiangiogénico, comprendiendo dicho método: 5

a) proporcionar una población celular enriquecida en células troncales vasculares según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17;

b) combinar dicha población celular con un compuesto candidato; 10 c) cultivar dicha población celular en condiciones apropiadas para el crecimiento y la diferenciación en células vasculares; y

d) determinar si la diferenciación de las células troncales vasculares en célula vascular está potenciada o 15 inhibida, indicando así que dicho compuesto candidato es respectivamente un compuesto angiogénico o antiangiogénico, respectivamente.

32. Composición que comprende: 20 a) una población celular enriquecida en células troncales vasculares según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17; y b) un vehículo fisiológicamente aceptable.

33. Composición según la reivindicación 32, para su utilización en la revascularización de células musculares esqueléticas y miocárdicas isquémicas o lesionadas.

34. Kit que comprende: 30 a) una población celular enriquecida en células troncales vasculares según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17; y

b) los reactivos necesarios para cultivar dichas células troncales vasculares. 35 35. Kit según la reivindicación 34, que comprende además una matriz extracelular.

36. Kit según la reivindicación 35, en el que dicha matriz extracelular es una membrana basal Matrigel o gel de colágeno.