Método de escisión de polipéptidos usando un mutante de la proteasa OmpT.

Un método de escisión de polipéptidos caracterizado porque hay arginina o lisina en la posición P1 de un sitio de escisión deseado en un polipéptido,

están situados un solo aminoácido básico o dos o tres aminoácidos básicos consecutivos en cualquier sitio de la secuencia aminoacídica desde la posición P10 a la posición P3 o desde la posición P3' a la posición P5' y se usa proteasa OmpT para escindir el sitio de escisión deseado en dicho polipéptido, en el que:

(1) la proteasa OmpT es una variante del aminoácido 97 de proteasa OmpT en la que el aminoácido 97 desde el extremo N de la proteasa OmpT es leucina, metionina o histidina; y

(2) el aminoácido P1' del polipéptido de sustrato es:

(a) serina o alanina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es leucina,

(b) fenilalanina, alanina, serina, cisteína o tirosina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es metionina, y

(c) alanina, valina, isoleucina, metionina, serina, treonina, cisteína o asparagina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es histidina.

Método de escisión de polipéptidos usando un mutante de la proteasa OmpT.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para escindir directamente un péptido, proteína o su derivado fisiológicamente activo de una proteína de fusión utilizando variantes de proteasa OmpT de E. coli. Más específicamente, se refiere a un método para la escisión de una proteína de fusión usando proteasa OmpT madura de E. coli en el que se sitúa un aminoácido básico en la posición P3, la posición P4 y la posición P5 del sitio de escisión para aumentar la eficacia de escisión en el enlace peptídico entre las posiciones P1 y P1’ del sitio de escisión, y

adicionalmente a un método de uso de una variante de proteasa OmpT que tiene modificada su especificidad de sustrato por la posición P1’ mediante la sustitución del aminoácido 97 desde el extremo N para una liberación y

producción eficaz de péptidos, proteínas y sus derivados fisiológicamente activos a partir de proteínas de fusión incluso cuando el aminoácido en el sitio P1’ sea un aminoácido distinto de arginina o lisina.

Antecedentes de la técnica La proteasa OmpT de E. coli está presente en las fracciones de membrana externa de E. coli y esta proteasa escinde selectivamente principalmente los enlaces peptídicos entre pares de aminoácidos básicos. Se encuentran también proteínas que tienen secuencias aminoacídicas homólogas con la proteasa OmpT de E. coli, y que tienen o se cree que tienen actividad proteasa, en bacterias intestinales tales como Salmonella, Yersinia y Shigella, y este grupo de proteínas es conocido como la familia de la omptina.

La proteasa OmpT de E. coli tiene un peso molecular de aproximadamente 33.500. Sugimura et al. han examinado la especificidad de sustrato de la proteasa OmpT y han reseñado que la enzima escinde específicamente los enlaces peptídicos centrales entre los pares de aminoácidos básicos arginina-arginina, lisina-lisina, arginina-lisina y lisinaarginina (Sugimura, K. y Nishihara, T. J. Bacteriol. 170: 5625-5632, 1988) .

Sin embargo, la enzima no escinde todos los pares de aminoácidos básicos, ya que es altamente específica. Por

ejemplo, el interferón γ humano contiene 10 pares de aminoácidos básicos, pero solo se escinden dos de ellos (Sugimura, K. y Higashi, N. J. Bacteriol. 170: 3650-3654, 1988) . Esto se atribuye a la influencia de la estructura tridimensional del sustrato interferón γ humano y a las secuencias aminoacídicas de los sitios que se cree que reconoce la enzima, que son adyacentes a los pares de aminoácidos básicos.

Las posiciones aminoacídicas de los sustratos designados a lo largo de la presente memoria descriptiva se asignan según el método de notación de Schechter y Berger (Schechter, I. y Berger, A. Biochem. Biophys. Research. Commun.

27: 157-162, 1967) . Es decir, el enlace peptídico entre la posición P1 y la posición P1’ de Pn...P2-P1-P1'-P2'... Pn' es el sitio de escisión, y los aminoácidos están representados por sus abreviaturas de una letra o tres letras estándares,

indicando ↓ el sitio de escisión.

Por ejemplo, si la escisión es entre lisina y arginina de la secuencia aminoacídica –leucina-tirosina-lisina-argininahistidina- (-Leu-Tyr-Lys↓Arg-His-) , en posición P3 está leucina, en posición P2 está tirosina, en posición P1 está lisina, en posición P1’ está arginina y en posición P2’ está histidina.

También, a menos que se especifique otra cosa, estas referencias se usarán como las posiciones aminoacídicas correspondientes a la secuencia original incluso cuando se haya introducido una sustitución aminoacídica en el sitio de escisión o en su secuencia aminoacídica circundante tal que no sea ya escindible o resulte un nuevo sitio de escisión.

Se han descubierto sitios de escisión de proteasa OmpT con secuencias aminoacídicas distintas de pares de aminoácidos básicos y Dekker et al., usando sustratos con sustituciones aminoacídicas introducidas en un sustrato de proteasa OmpT que comprende la secuencia aminoacídica Ala-Arg-Arg-Ala (P2-P1↓P1'-P2') , han reseñado que la proteasa OmpT exhibe una alta especificidad por los aminoácidos básicos arginina y lisina como aminoácido en posición P1 del sitio de escisión, pero es menos rigurosa con respecto al aminoácido en la posición P1’ (Dekker, N. et al. Biochemistr y 40: 1694-1701, 2001) .

Además, los presentes inventores, usando como sustrato una proteína de fusión capaz de escindirse por la enzima en condiciones desnaturalizantes de polipéptidos en presencia de urea, en la que se introduce una sustitución aminoacídica en la posición P1’ de la proteína de fusión, han descubierto que aparece escisión cuando la posición aminoacídica P1’ es un aminoácido distinto de ácido aspártico, ácido glutámico o prolina (Okuno, K. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66; 127-134, 2002, solicitud de patente japonesa nº 2000-602803) . Sin embargo, la eficacia de escisión en estos casos es todavía menor que cuando el residuo aminoacídico en la posición P1’ es arginina o lisina.

En cuanto a la especificidad con respecto a las secuencias adyacentes al sitio de escisión, se ha demostrado que no ocurre escisión cuando está presente un aminoácido ácido en la posición P2 o P2’ (Dekker, N. et al. Biochemistr y 40: 1694-1701, 2001) .

Los presentes inventores han reseñado también que la eficacia de escisión aumenta cuando está presente arginina o lisina como aminoácido básico en la posición P4 o la posición P6, mientras que a la inversa se reduce en el caso de un aminoácido ácido tal como ácido aspártico o ácido glutámico (Okuno, K. et al. Biotechnol. Appl. Biochem. 36: 7784, 2002, solicitud de patente japonesa 2000-602803) .

Aunque no se ha establecido la especificidad por otras secuencias adyacentes al sitio de escisión, el hecho de que la proteasa OmpT escinda protaminas, que son péptidos antimicrobianos altamente básicos (Stumpe, S. et al. J. Bacteriol.

180: 4002-4006, 1998) , y que se encuentren muchos aminoácidos básicos en el dominio extracelular de la proteasa OmpT implicado en la actividad proteasa (Vandeputte-Rutten, L. et al. EMBO J. 20: 5033-5039, 2001) , sugiere que los efectos de carga son importantes para la interacción entre la proteasa OmpT y su sustrato.

Respecto a las aplicaciones de la proteasa OmpT, la alta especificidad del sitio de escisión y el hecho de que la proteasa esté presente en la membrana externa de E. coli significa que la proteasa puede usarse como enzima procesadora para liberar polipéptidos diana a partir de proteínas de fusión creadas mediante técnicas de recombinación génica.

Hanke et al., al llevar a cabo la secreción de colesterol esterasa usando E. coli, la fusionaron con la proteína hemolisina A de E. coli, secretaron la proteína de fusión extracelularmente y permitieron a la proteasa OmpT de la membrana externa actuar sobre ella, obteniendo así exitosamente colesterol esterasa activa a partir de la proteína de fusión. Aquí, se añadió un ligador con una secuencia de arginina-lisina para la escisión de la secuencia con proteasa OmpT (Hanke,

C. et al. Mol. General. Genet. 233: 42-48, 1992) .

Los presentes inventores han descubierto que la proteasa OmpT es resistente a agentes desnaturalizantes, y han utilizado esta propiedad para mostrar que las proteínas de fusión expresadas como cuerpos de inclusión pueden escindirse en presencia de agentes desnaturalizantes. Específicamente, se expresó una proteína de fusión derivada de proteasa V8 de Staphylococcus aureus como cuerpo de inclusión en un sistema de expresión de E. coli, se solubilizó con urea y se hizo actuar entonces la proteasa OmpT en presencia de urea, lo que daba como resultado la liberación de la porción de derivado de proteasa V8 a partir de la proteína de fusión, y el posterior replegamiento permitía la producción exitosa del derivado de proteasa V8 con actividad enzimática (Yabuta, M. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol.

44: 118-125, 1995) .

Normalmente, la liberación de un polipéptido o proteína diana a partir de una proteína de fusión se logra usando una enzima con una alta especificidad de secuencia aminoacídica como enzima procesadora. Las proteasas conocidas usadas en dichos casos incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa, pero debido a que estas enzimas son enzimas derivadas de mamíferos y por lo tanto de suministro escaso y costosas, no son adecuadas para el procesamiento masivo industrial de péptidos y proteínas mediante métodos de proteínas de fusión. Además, cuando el polipéptido... [Seguir leyendo]

1. Un método de escisión de polipéptidos caracterizado porque hay arginina o lisina en la posición P1 de un sitio de escisión deseado en un polipéptido, están situados un solo aminoácido básico o dos o tres aminoácidos básicos consecutivos en cualquier sitio de la secuencia aminoacídica desde la posición P10 a la posición P3 o desde la posición P3’ a la posición P5’ y se usa proteasa OmpT para escindir el sitio de escisión deseado en dicho polipéptido, en el que:

(1) la proteasa OmpT es una variante del aminoácido 97 de proteasa OmpT en la que el aminoácido 97 desde el extremo N de la proteasa OmpT es leucina, metionina o histidina; y

(2) el aminoácido P1' del polipéptido de sustrato es:

(a) serina o alanina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es leucina,

(b) fenilalanina, alanina, serina, cisteína o tirosina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es metionina, y

(c) alanina, valina, isoleucina, metionina, serina, treonina, cisteína o asparagina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es histidina.

2. Un método para producir un péptido diana caracterizado porque se obtiene un péptido diana a partir de una proteína de fusión, siendo el sitio de escisión de la proteína de fusión un sitio de escisión deseado como se define en la reivindicación 1, y comprendiendo un péptido protector cuyo extremo N es arginina o lisina, fusionado con un péptido diana mediante el sitio de escisión deseado que puede escindirse por una variante del aminoácido 97 de proteasa OmpT como se define en la reivindicación 1, en el que se transforman células hospedadoras con un plásmido de expresión que tiene un gen que codifica la proteína de fusión, expresándose dicho gen en dichas células y escindiéndose por dicha proteasa en dicho sitio de escisión, y en el que el extremo N del péptido diana es:

(a) serina o alanina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es leucina,

(b) fenilalanina, alanina, serina, cisteína o tirosina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es metionina, y

(c) alanina, valina, isoleucina, metionina, serina, treonina, cisteína o asparagina cuando el aminoácido 97 de la variante de proteasa OmpT es histidina.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende situar dos o tres aminoácidos básicos consecutivos entre las posiciones P10 y P3 del sitio de escisión deseado en el polipéptido o proteína de fusión.

4. El método de la reivindicación 3, que comprende situar tres aminoácidos básicos consecutivos entre las posiciones P5 y P3 del sitio de escisión deseado en el polipéptido o proteína de fusión.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los aminoácidos básicos son arginina y/o lisina.

6. El método de la reivindicación 5, en el que los aminoácidos básicos son arginina.

7. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia aminoacídica de las posiciones P5 a P1 del sitio de escisión deseado en el polipéptido o proteína de fusión es Arg-Arg-Arg-Ala-Arg.

8. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia aminoacídica de las posiciones P7 a P1 del sitio de escisión deseado en el polipéptido o proteína de fusión es Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que el péptido diana es un péptido compuesto por entre 22 y 45 residuos aminoacídicos.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el péptido diana es hormona adrenocorticotrópica humana (1-24) , motilina o precursor de calcitonina.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que las células hospedadoras son E. coli.

12. El método de cualquier reivindicación precedente, que comprende usar como proteasa de escisión células bacterianas que expresan un gen que codifica la variante del aminoácido 97 de la proteasa OmpT.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende coexpresar un gen que codifica la variante del aminoácido 97 de la proteasa OmpT y un gen que codifica un polipéptido o proteína de fusión cuya escisión por dicha proteasa es deseada.