Medios para prevenir y tratar la muerte celular y sus aplicaciones biológicas.

Un compuesto adecuado para inhibición de la actividad caspasa-2 que tiene la SEC ID Nº:

5: quinolinilcarbonil-LValinil-L-Aspartil (metil éster) -L-Valinil-L-Alaninil-L-Aspartil (metil éster) 2, 6-difluorofenil éster.

Medios para prevenir y tratar la muerte celular y sus aplicaciones biológicas.

La invención se refiere a medios, procedimientos y productos para bloquear, prevenir o tratar la muerte celular, particularmente la muerte de las células neuronales.

La muerte de las células neuronales se produce durante la embriogénesis para eliminar el exceso de neuronas para garantizar conexiones pre y post sinápticas y permitir la formación de un cerebro adulto funcional.

Además de la muerte postmitótica relacionada con el envejecimiento normal, factores ambientales o mutacionales genéticos pueden inducir la muerte neuronal en el ser humano adulto durante lesiones agudas (por ejemplo, isquemia por hipoxia, ictus, lesión de médula espinal, traumatismo) o enfermedades neurodegenerativas crónicas.

La muerte celular asociada con estos trastornos puede producirse mediante tres mecanismos diferentes, que presentan características morfológicas y bioquímicas de necrosis, autofagia o apoptosis. A menudo las muertes neuronales tanto fisiológicas como patológicas están asociadas con una regulación defectuosa de la apoptosis y las rutas de señalización que conducen a este mecanismo suicida de células activo pueden dividirse en las rutas dependientes de proteasa específica de cisteinil aspartato (caspasa) frente a las independientes de caspasa en células de mamíferos.

La apoptosis neuronal es un mecanismo suicida celular activo que puede dividirse en fases secuenciales, incluyendo iniciación, decisión, ejecución y degradación. Esta cascada de acontecimientos la dirige la activación de una maquinaria específica que implica tanto la activación de las proteasas específicas de aspartato dependientes de cisteína (caspasas) como las mitocondrias que pueden actuar como un orgánulo regulador (o amplificador) decisivo. De hecho, las alteraciones mitocondriales incluyen pérdida de gradiente electroquímico en la membrana interna mitocondrial ("'m) y la liberación de factores apoptogénicos tales como citocromo c, Smac/Diablo y el Factor Inductor de Apoptosis. Una vez liberados de la mitocondria, estos efectores desencadenan la desarticulación nuclear y citoplásmica independiente de caspasa y/o dependiente de caspasa. Por tanto, los factores mitocondriales combinados con caspasas contribuyen a la fase de degradación de la apoptosis, dando como resultado una contracción celular, condensación nuclear, emisión de cuerpos apoptóticos y aparición de señales “cómeme” tales como translocación de fosfatidilserinas en la lámina externa de la membrana plasmática. En ausencia de fagocitos, las células inmersas en apoptosis finalmente experimentan alteración de la membrana plasmática no específica denominada necrosis secundaria.

La construcción respectiva de las mitocondrias, caspasas y otros acontecimientos durante la apoptosis neuronal aún no está aclarada, particularmente con respecto a un acoplamiento de tipo inductor de muerte/celular determinado.

Hasta hace poco, la apoptosis y necrosis de células neuronales se había investigado principalmente en dos tipos de estrategias: el primer grupo de técnicas (bioquímicas) evalúa acontecimientos tardíos de muerte neuronal generalmente por evaluación colorimétrica de la actividad mitocondrial succinato deshidrogenasa (ensayo MTT) o liberación extracelular de actividad lactato deshidrogenasa (ensayo LDH) . Estas técnicas cuantitativas monoparamétricas rutinarias no proporcionan información en lo que respecta al mecanismo de la muerte celular y no pueden combinarse con la detección de otros procesos bioquímicos.

Más recientemente, algunos protocolos de fraccionamiento celular adaptados a neuronas se publicaron para la evaluación bioquímica de translocación del citocromo c por inmunotransferencia y activación de caspasas utilizando sustratos fluorogénicos. Dichos procedimientos recientes proporcionan informaciones cuantitativas acerca de las poblaciones neuronales pero excluyen análisis multiparamétricos y en tiempo real. El segundo grupo de técnicas utilizan lecturas de microscopía de fluorescencia (FM) para detectar modificaciones de orgánulos o proteínas relacionadas con apoptosis. La mayoría de estos estudios de FM están centrados en alteraciones nucleares tardías incluyendo visualización de la morfología de la cromatina (tinción de Hoechst) y/o detección bioquímica de la fragmentación del ADN (ensayo TUNEL) . En algunos estudios de FM recientes sobre neuronas, se publicó la inmunolocalización del citocromo c (en células fijas) pero a diferencia de otros campos de la biología celular, un número limitado de estudios sobre neuronas utilizó la detección in situ de alteraciones mitocondriales y activación de caspasa. Cuando se aplica a neuronas primarias cultivadas, los análisis basados en FM requieren mucho tiempo, son laboriosos y la cuantificación se ve dificultada por agregados de cuerpos celulares y solapamiento de redes neuríticas. Además, el fotoblanqueo de sondas fluorescentes sensibles podría conducir a interpretaciones erróneas drásticas y excluir el seguimiento en tiempo real de acontecimientos relacionados con la muerte temprana. Por tanto, las características de la biología celular de sucesos apoptóticos clave aún no se han documentado y ordenado completamente en neuronas primarias.

El documento WO 02/34201 desvela el uso de un inhibidor de la apoptosis de pericitos retinales para prevenir y/o tratar la retinopatía diabética.

Los autores de la presente invención han desarrollado una estrategia complementaria y cuantitativa para analizar la dinámica de fenómenos de apoptosis útiles, particularmente, para neuronas corticales primarias o líneas celulares neuronales o líneas celulares no neuronales.

Dicha estrategia conduce a los autores de la presente invención a desarrollar un nuevo procedimiento para organizar y analizar los acontecimientos moleculares relacionados con la apoptosis. Para evaluar con este procedimiento la cronología y jerarquía de los acontecimientos relacionados con la apoptosis en las células neuronales, los autores de la invención han elaborado un modelo de muerte aguda experimental para determinar la comprobación reversible más próxima que interfiere con los procesos apoptóticos y han aplicado dicho procedimiento a este modelo. Ventajosamente, esta evaluación puede realizarse en células neuronales, líneas celulares neuronales así como células no neuronales y en líneas celulares no neuronales.

El objetivo de la invención es por tanto proporcionar un procedimiento analítico multiparamétrico y de plataforma de formación de imágenes para identificar la comprobación en la célula para impedir la muerte celular y para su uso para bloquear y prevenir la muerte celular.

Otro objetivo de la presente invención es que los inventores proporcionan procedimientos en tiempo real después de una o más marcas apoptóticas en neuronas o líneas celulares.

Otro objetivo de la invención es proporcionar nuevos compuestos que induzcan el silenciamiento génico de caspasa2 (denominada también Nedd-2; Ich-1) , o inhiban la actividad caspasa-2 proapoptótica (o interfieran con los procesos aguas abajo dependientes de caspasa-2) .

Otro objetivo de la invención es proporcionar composiciones farmacéuticas y procedimientos de tratamiento de enfermedades y lesiones en los que esté implicada la caspasa-2.

El alcance de la invención está limitado por las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se desvela un procedimiento para prevenir la muerte celular que comprende la determinación, dependiendo de un modo de inducción determinado, en un tipo celular determinado, de la jerarquía de los acontecimientos relacionados con la apoptosis y el bloqueo del control reversible más próximo para interferir con procesos apoptóticos.

Este procedimiento se realiza ventajosamente combinando la citometría de flujo cuantitativa rápida y la microscopía de fluorescencia cuantitativa/cualitativa en neuronas. También es ventajoso realizarlo en células no neuronales. Dicho procedimiento también puede usarse en líneas celulares neuronales.

El uso de estas dos tecnologías permite la co-detección de las fases de decisión, efectora, degradación temprana y tardía de apoptosis.

Como se ilustra en los ejemplos, la invención proporciona medios para desarrollar un control de citometría de flujo en tiempo real fiable de "' m y membranas plasmáticas, granularidad morfológica nuclear y celular y cambios del tamaño celular en respuesta a daños neurotóxicos que incluyen tratamiento con MPTP.

Utilizando sondas fluorescentes no solapantes específicas, y/o anticuerpos específicos y/o agentes farmacológicos,... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto adecuado para inhibición de la actividad caspasa-2 que tiene la SEC ID Nº: 5: quinolinilcarbonil-LValinil-L-Aspartil (metil éster) -L-Valinil-L-Alaninil-L-Aspartil (metil éster) 2, 6-difluorofenil éster.

2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la 5 reivindicación 1 en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Un compuesto que tiene la SEC ID Nº: 5: quinolinilcarbonil-L-Valinil-L-Aspartil (metil éster) -L-Valinil-L-Alaninil-LAspartil (metil éster) 2, 6-difluorofenil éster para su uso como un medicamento.

4. Un compuesto que tiene la SEC ID Nº: 5: quinolinilcarbonil-L-Valinil-L-Aspartil (metil éster) -L-Valinil-L-Alaninil-L

Aspartil (metil éster) 2, 6-difluorofenil éster para su uso en el tratamiento de una situación patológica que incluye 10 hipoxia-isquemia, H-I, lesiones y situaciones similares a ictus.

5. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la lesión H-I es hipoxia-isquemia cerebral.

6. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el estado patológico es muerte neuronal, particularmente en hipoxia-isquemia global o focal.

7. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el estado patológico es muerte neuronal, particularmente en hipoxia-isquemia en adultos o neonatal.

8. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el estado patológico es muerte neuronal, particularmente en hipoxia-isquemia transitoria o permanente.

9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el estado patológico es muerte neuronal, 20 particularmente en Oclusión de Arteria Cerebral Media (OACM) .