Procedimiento para la secuenciación de un molde polinucleotídico.

Un procedimiento para la secuenciación por pares de una primera y segunda regiones de un polinucleótido dedoble hebra diana,

en el que dichas primera y segunda regiones están en el mismo polinucleótido de doble hebradiana, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un soporte sólido que tiene inmovilizado sobre él una pluralidad de polinucleótidos molde dedoble hebra formados cada uno a partir de una primera y segunda hebras molde complementarias unidas alsoporte sólido en sus extremos 5' y múltiples copias de uno o más cebadores inmovilizados en el extremo 5'capaces de hibridar con el extremo 3' de la primera hebra del molde;

(b) eliminar selectivamente las segundas hebras del molde de la pluralidad de polinucleótidos molde de doblehebra para permitir la hibridación de las primeras hebras molde con cebadores inmovilizados en el extremo5';

(c) llevar a cabo una primera lectura de secuenciación para determinar la secuencia de una primera regióndel polinucleótido molde mediante una técnica de secuenciación por síntesis o mediante una técnica desecuenciación por ligación;

(d) llevar a cabo una reacción de extensión para extender uno o más de los cebadores inmovilizados paracopiar la primera hebra del molde para generar una segunda hebra del molde inmovilizada;

(e) eliminar selectivamente las primeras hebras del molde de la pluralidad de polinucleótidos molde de doblehebra para permitir la hibridación de un cebador de secuenciación con las hebras del molde generadas en laetapa (d);

(f) llevar a cabo una segunda lectura de secuenciación para determinar la secuencia de una segunda regióndel polinucleótido molde, mediante una técnica de secuenciación por síntesis o mediante una técnica desecuenciación por ligación, en el que determinar las secuencias de la primera y segunda regiones delpolinucleótido diana logra la secuenciación por pares de dichas primera y segunda regiones de dichopolinucleótido de doble hebra diana.

Procedimiento para la secuenciación de un molde polinucleotídico

Campo de la invención [0001] La invención se refiere a procedimientos para la secuenciación por pares de un molde de polinucleótido de doble hebra, a procedimientos que tienen como resultado la determinación secuencial de las secuencias de nucleótidos en dos regiones distintas y separadas del molde de polinucleótido.

Antecedentes de la invención [0002] En esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones y documentos de patente con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

Los avances en el estudio de moléculas biológicas han ido precedidos, en parte, por la mejora en las tecnologías usadas para caracterizar las moléculas o sus reacciones biológicas. En particular, el estudio de los ácidos nucleicos ADN y ARN se ha beneficiado del desarrollo de tecnologías que se utilizan para el análisis de secuencia.

Un procedimiento para la secuenciación de una molde de polinucleótido implica la realización de múltiples reacciones de extensión utilizando una ADN polimerasa para incorporar sucesivamente nucleótidos marcados a una hebra molde. En una reacción de "secuenciación por síntesis" de este tipo, se crea una nueva hebra de nucleótidos con bases emparejadas a la hebra molde en la dirección 5' a 3' por la incorporación sucesiva de nucleótidos individuales complementarios a la hebra molde. Si se utiliza de forma simultánea, los nucleósidos trifosfato sustrato utilizados en la reacción de secuenciación pueden ser bloqueados para evitar el exceso de incorporación y marcados diferentes, lo que permite la determinación de la identidad del nucleótido incorporado a medida que se añaden nucleótidos sucesivos.

Con el fin de llevar a cabo la secuenciación precisa se puede añadir una modificación estructural terminadora de hebra reversible o "grupo de bloqueo" a los nucleótidos sustrato para garantizar que los nucleótidos se incorporan de uno en uno de una manera controlada. A medida que se incorpora cada nucleótido único, el grupo de bloqueo impide la incorporación de más nucleótidos en la hebra de polinucleótido. Una vez que la identidad del nucleótido marcado incorporado en último lugar se ha determinado, se eliminan el resto marcador y el grupo de bloqueo,

permitiendo que el siguiente nucleótido marcado bloqueado se incorpore en una ronda posterior de secuenciación.

En determinadas circunstancias, la cantidad de datos de la secuencia que se puede obtener con fiabilidad con el uso de técnicas de secuenciación por síntesis, particularmente cuando se usan nucleótidos marcados bloqueados puede ser limitada. En algunas circunstancias, se prefiere limitar el "ciclo" de secuenciación a un número de bases que permite la realineación de la secuencia con el genoma humano, habitualmente alrededor de 25-30 ciclos de incorporación. Aunque los ciclos de secuenciación de esta longitud son extremadamente útiles, en particular en aplicaciones, tales como, por ejemplo, análisis de SNP y genotipado, sería ventajoso en muchas circunstancias poder obtener de manera fiable más datos de la secuencia para la misma molécula molde.

La técnica de secuenciación de "extremos emparejados" o secuenciación "por pares" se conoce habitualmente en la técnica de la biología molecular, en particular en el contexto de la secuenciación aleatoria del todo el genoma. La secuenciación de extremos emparejados permite la determinación de dos "lecturas" de la secuencia de dos lugares en un solo dúplex polinucleótido. La ventaja del procedimiento de extremos emparejados es que existe significativamente más información que se puede obtener a partir de la secuenciación de dos tramos cada uno de "n" bases de un solo molde que de la secuenciación de "n" bases de cada uno de dos moldes independientes de forma aleatoria. Con el uso de herramientas de software adecuadas para el montaje de la información de la secuencia, es posible hacer uso del conocimiento de que las secuencias con "extremos emparejados" no son completamente aleatorias, sino que se sabe que se producen en una sola dúplex, y por lo tanto están vinculadas o emparejadas en el genoma. Se ha demostrado que esta información ayuda en gran medida 55 al montaje de secuencias del genoma completo en una secuencia de consenso.

La secuenciación de extremos emparejados normalmente se ha realizado mediante el uso de vectores de clonación aleatorios circulares especializados. Después de cortar el vector en un sitio simple específico, el molde de ADN a secuenciar (típicamente ADN genómico) se inserta en el vector y los extremos se vuelven a cerrar para formar una nueva construcción. Las secuencias del vector que flanquean el inserto de ADN incluyen sitios de unión para cebadores de secuenciación que permiten la secuenciación del inserto de ADN en hebras opuestas. Sin embargo, la necesidad de cebadores de secuenciación en ambos extremos del fragmento de molde hace que el uso de técnicas de secuenciación basadas en matrices sea extremadamente difícil. Con las técnicas basadas en matrices, que por lo general se basan en un molde de hebra sencilla, por lo general sólo es posible secuenciar

desde un extremo de un molde de nucleótidos, ya que la hebra complementaria no está unida a la superficie.

Se han descrito varios procedimientos para la secuenciación de extremos doble de una molde de polinucleótido que se pueden llevar a cabo sobre un soporte sólido, por ejemplo, en los documentos US20060024681, US20060292611, WO06110855, WO06135342, WO03074734, WO07010252, WO07091077y W000179553.

El documento DE10051564A1 es una solicitud de patente alemana de Axaron Bioscience, que divulga procedimientos de secuenciación utilizando moldes de ácidos nucleicos inmovilizados y cebadores de colonias, que pueden hibridarse al extremo 3' del molde, en el que los moldes se copian por extensión del cebador y la secuenciación se lleva a cabo a partir de un extremo.

Los documentos WO 98/44151y WO 00/18957 describen procedimientos de amplificación de ácido nucleico que permiten inmovilizar los productos de amplificación en un soporte sólido con el fin de formar matrices compuestas de agregados o "colonias" formadas a partir de una pluralidad de hebras idénticas de polinucleótidos inmovilizadas y una pluralidad de hebras complementarias inmovilizadas idénticas. Las moléculas de ácidos nucleicos presentes en las colonias de ADN en las matrices agrupadas preparadas de acuerdo con estos procedimientos pueden proporcionar moldes para las reacciones de secuenciación, por ejemplo, como se describe en el documento WO 98/44152. Es ventajoso permitir la secuenciación eficiente de ambas hebras de tales agregados, como se describe en detalle en los procedimientos de la presente memoria.

Descripción resumida de la invención [0012] Los presentes inventores han desarrollado ahora procedimientos tal como se definen en las reivindicaciones para la secuenciación con extremos emparejados de moldes de polinucleótidos de doble hebra, incluyendo moldes de doble hebra presentes en las matrices agregadas, tales como las descritas en este documento. Los procedimientos permiten la secuenciación de dos regiones distintas, una en cada extremo de las hebras complementarias de un dúplex de polinucleótido diana. Utilizando los procedimientos de la invención, es posible obtener dos lecturas unidas o emparejadas de la información de la secuencia de cada molde de doble hebra en una matriz agregada, en lugar de una sola secuencia de lectura de una hebra del molde.

De acuerdo con un procedimiento de la invención, se proporciona un procedimiento para la secuenciación por pares de una primera y segunda regiones de un polinucleótido de doble hebra diana, en el que dichas primera y segunda regiones están en el mismo polinucleótido de doble hebra diana, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un soporte sólido que tiene inmovilizado sobre él una pluralidad de polinucleótidos molde de doble hebra formados cada uno a partir de una primera y segunda hebras molde complementarias unidas al soporte sólido en sus extremos 5' y múltiples copias de uno o más cebadores inmovilizados en el extremo 5' capaces de hibridar con el extremo 3' de la primera hebra del molde;

(b) tratar la pluralidad de polinucleótidos molde de doble hebra de tal manera que las primeras hebras molde hibridan con cebadores inmovilizados en el extremo 5';

(c) llevar a cabo una primera lectura de secuenciación para determinar la secuencia de una primera región del polinucleótido molde;

(d) llevar a cabo una reacción de extensión para extender uno o más de los cebadores inmovilizados... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la secuenciación por pares de una primera y segunda regiones de un polinucleótido de doble hebra diana, en el que dichas primera y segunda regiones están en el mismo polinucleótido de doble hebra 5 diana, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un soporte sólido que tiene inmovilizado sobre él una pluralidad de polinucleótidos molde de doble hebra formados cada uno a partir de una primera y segunda hebras molde complementarias unidas al soporte sólido en sus extremos 5' y múltiples copias de uno o más cebadores inmovilizados en el extremo 5' capaces de hibridar con el extremo 3' de la primera hebra del molde;

(b) eliminar selectivamente las segundas hebras del molde de la pluralidad de polinucleótidos molde de doble hebra para permitir la hibridación de las primeras hebras molde con cebadores inmovilizados en el extremo 5';

(c) llevar a cabo una primera lectura de secuenciación para determinar la secuencia de una primera región

del polinucleótido molde mediante una técnica de secuenciación por síntesis o mediante una técnica de secuenciación por ligación;

(d) llevar a cabo una reacción de extensión para extender uno o más de los cebadores inmovilizados para copiar la primera hebra del molde para generar una segunda hebra del molde inmovilizada;

(e) eliminar selectivamente las primeras hebras del molde de la pluralidad de polinucleótidos molde de doble hebra para permitir la hibridación de un cebador de secuenciación con las hebras del molde generadas en la etapa (d) ;

(f) llevar a cabo una segunda lectura de secuenciación para determinar la secuencia de una segunda región del polinucleótido molde, mediante una técnica de secuenciación por síntesis o mediante una técnica de secuenciación por ligación, en el que determinar las secuencias de la primera y segunda regiones del

polinucleótido diana logra la secuenciación por pares de dichas primera y segunda regiones de dicho polinucleótido de doble hebra diana.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las lecturas de secuenciación se realizan utilizando nucleótidos u oligonucleótidos marcados.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los moldes se inmovilizan en un único soporte sólido plano o en una pluralidad de microesferas.

4. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que la eliminación selectiva en las etapas 1 (b) o 35 1 (e) , implica el corte de los polinucleótidos molde de doble hebra inmovilizados con una endonucleasa.

5. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que la eliminación selectiva en las etapas 1 (b) o 1 (e) , implica la formación y escisión de un sitio abásico en los polinucleótidos molde de doble hebra inmovilizados.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho sitio abásico se genera a partir de una base uracilo o una base 8-oxo-guanina.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el uracilo se elimina mediante tratamiento con

uracilo ADN glicosilasa (UDG) y Endonucleasa ADN glicosilasa-liasa VIII. 45

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la etapa adicional previa a la etapa 1

(c) de convertir el molde inmovilizado en monocatenario.

9. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera hebra del molde se une a través de un conector diol que se escinde por tratamiento con un agente de escisión química que comprende per y odato y el dúplex se desnaturaliza a continuación.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa 1 (d) se repite a través de múltiples ciclos

de extensión y desnaturalización. 55

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos uno de los cebadores inmovilizados está bloqueado en el extremo 3' y el bloque se elimina antes de la etapa 1 (d) .

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el bloque es un grupo fosfato y la superficie se trata con una fosfatasa para eliminar el bloque.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido de doble hebra diana comprende un marcador de secuencia nucleotídica específica para identificar la fuente del polinucleótido.

14. Uso del procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para obtener dos lecturas unidas o emparejadas de información de la secuenciación de cada molde de doble hebra en una matriz agregada.

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citada en la descripción