Procedimiento para la identificación de la actividad agonista sobre un canal de potasio de un compuesto diana.

Procedimiento para la identificación de la actividad agonista de un compuesto diana sobre un canal de potasio dependiente del voltaje,

caracterizado porque

a) se prepara una población de células que expresan dicho canal de potasio;

b) se incuban las células de a) con un colorante fluorescente sensible al voltaje;

c) se añade el compuesto diana a la mezcla de reacción de b);

d) se determina un valor F1 de la intensidad de fluorescencia de las células;

e) se añaden iones potasio en una concentración fisiológicamente compatible;

f) se determina un valor F2 de la intensidad de fluorescencia de las células;

g) se compara la intensidad de fluorescencia F2 con la intensidad de fluorescencia F1 y se averigua la actividad agonista del compuesto diana sobre el canal de potasio.

Procedimiento para la identificación de la actividad agonista sobre un canal de potasio de un compuesto diana.

La presente invención se refiere a un procedimiento o a un ensayo para la identificación de la actividad agonista de un compuesto diana sobre un canal de iones potasio dependiente de la tensión.

Los canales iónicos son esenciales para el funcionamiento de las células nerviosas y musculares, al igual que para la mayoría de otras células somáticas. Los canales iónicos participan en prácticamente todos los procesos fisiológicos, por ejemplo en los impulsos eléctricos sobre los que se basan las funciones sensoriales y motoras del cerebro, en el control de la actividad contráctil del corazón, en la musculatura lisa de los vasos óseos e intestinales, así como en la absorción de nutrientes, la secreción hormonal y la secreción y el desarrollo celular.

Los canales iónicos permiten que los iones atraviesen la bicapa lípida hidrófoba de la membrana celular, lo que es decisivo para generar y transmitir las señales eléctricas en células vivas. Los canales iónicos pueden clasificarse según su selectividad iónica. Algunos canales iónicos son permeables para cierto tipo de iones bien determinado, por ejemplo para los iones sodio (Na+) , potasio (K+) o calcio (Ca2+) . Por el contrario, otros canales no pueden distinguir o sólo lohacen en escasa medida los tipos de iones. Éstos se denominan canales iónicos no selectivos. La apertura o el cierre de los canales iónicos pueden ser controlados por diferentes mecanismos. Los canales iónicos dependientes de ligandos, por ejemplo, son controlador por el enlace directo de ligandos intra o extracelulares. Los canales iónicos dependientes de la tensión, por el contrario, reaccionan cuando varía el potencial de membrana.

El potencial de membrana celular se debe al gradiente eléctrico y al gradiente de concentración de los diferentes iones y partículas cargadas a ambos lados de la membrana celular. Especial importancia tiene aquí la distribución de los iones sodio y potasio en el medio intra y extracelular. La distribución de los iones se basa en la permeabilidad selectiva de la membrana a los diferentes iones y su transporte activo mediante bombas de iones.

La actividad de estas “bombas” accionadas por el ATP celular conduce a una distribución desigual de los diferentes iones – especialmente de K+, Na+, Ca2+ y Cl- y otros aniones orgánicos – a ambos lados de la membrana celular y, con ello, a gradientes iónicos en la membrana. Así, en estado de reposo se produce un exceso de carga negativa en el lado interior de la membrana en comparación con su lado exterior. Esta separación de cargas resulta en una diferencia de potencial a través de la membrana celular, lo que se denomina potencial de membrana (Vm) .

En reposo, el potencial de membrana en las neuronas y células musculares oscila en el rango de -60 mV a -80 mV (denominado potencial de membrana en reposo) . Las señales eléctricas en las neuronas y células musculares se basan en cambios cortos del potencial de membrana. Estos cambios son provocados por la apertura y cierre transitorios de los canales iónicos, lo que resulta en un flujo de corriente eléctrica a través de la membrana. Si se reduce la separación de cargas en la membrana se habla de despolarización de membrana – el potencial de membrana se vuelve menos negativo. Un aumento de la separación de cargas se denota hiperpolarización, puesto que se produce un potencial de membrana más negativo que el potencial de membrana en estado de reposo.

El potencial de membrana en estado de reposo es un llamado potencial de difusión y queda determinado por diferentes factores. Las moléculas sin carga, por ejemplo oxígeno, dióxido de carbono, urea, etc., pueden atravesar libremente la bicapa lipídica hidrófoba de la membrana celular. Por el contrario, los iones, partículas cargadas, sólo pueden atravesar la membrana celular con ayuda de poros selectivos de naruraleza proteica (canales iónicos) . Debido a su permeabilidad selectiva para determinadas especies iónicas, la membrana celular es una membrana semipermeable. La actividad de las “bombas” accionadas por el ATP en la membrana celular resulta en una distribución desigual de los diferentes iones – especialmente K+, Na+, Ca2+, Cl- y aniones orgánicos – a ambos lados de la misma y, por tanto, a gradientes iónicos en la membrana. En la Tabla 1 se muestra la concentración intracelular y extracelular de distintos tipos importantes de iones. La semipermeabilidad de la membrana celular y la desigual distribución iónica a ambos lados de la misma resulta en un potencial de membrana en reposo.

Tabla 1 Concentración de los tipos de iones más importantes dentro y fuera de una célula

Ion Concentración extracelular (mM) Concentración intracelular (mM)

Na+ 145 12

K+ 4 155

Ca2+ 1, 5 0, 0001

Cl- 123 4, 2

En este contexto y de forma simplificada, se considera que una membrana celular sólo es permeable a un tipo de iones, por ejemplo a los iones potasio (K+) . Los iones K+ existen en la célula en concentraciones muy altas en comparación con el entorno. Por esta razón, los iones K+ se difunden, debido al gradiente químico, desde el interior de la célula hacia su exterior. La difusión de K+ desde la célula, sin embargo, es autolimitativa. El flujo de salida de los iones K+ de carga positiva y el exceso resultante de aniones impermeables de carga negativa en la célula conducen a que el interior de la célula sea negativo. Debido a esta separación de cargas, se genera una diferencia de potencial eléctrico en la membrana celular. Cuanto más iones K+ abandonen ahora la célula, tanto mayor será la separación de cargas y tanto mayor resultará la diferencia de potencial, volviéndose el interior de la célula cada vez más negativo. Finalmente, esta diferencia de potencial eléctrico actúa en contra del flujo de salida de los iones K cargados positivamente.

Esto significa que existen dos fuerzas opuestas que afectan a la difusión del potasio a través de la membrana celular: a) el impulso químico dependiente de la diferencia de concentración de potasio y b) el impulso eléctrico determinado por la diferencia de potencial eléctrico en la membrana.

Por tanto, la difusión del potasio conduce, después de un corto tiempo, a un potencial de membrana donde el impulso químico, que hace salir los iones K+ de la célula, es exactamente de la misma magnitud que el impulso eléctrico del potencial de membrana que actúa en contra de la salida de los iones K+. En el momento exacto en que se alcanza este potencial de membrana, ya no se produce flujo neto alguno de iones K+ en la membrana. Este potencial se denomina “potencial de equilibrio del potasio” (EK) .

Ecuación 1: Ecuación de Nernst para el potasio (a 37ºC) [lon] = concentración (a) extracelular (i) intracelular

Con ayuda de la ecuación de Nernst se puede calcular el potencial de equilibrio para los iones potasio.

Según la ecuación de Nernst (Ecuación 1) el potencial de equilibrio del potasio se calcula dividiendo las concentraciones de potasio a ambos lados de la membrana celular. Si se utilizan las concentraciones de potasio indicadas en la Tabla 1, resulta un potencial de equilibrio para el potasio de -98 mV. Así, el potencial de membrana de una célula, cuya membrana es selectivamente permeable al potasio, correspondería exactamente a EK y sería de -98 mV.

Tabla 2 Concentración extracelular e intracelular de los tipos de iones más importantes (ver Tabla 1) y su potencial de equilibrio resultante

Ion Concentración extracelular (mM) Concentración intracelular (mM) Potencial de equilibrio (mV)

Na+ 145 12 +67

K+ 4 155 -98

Ca2+ 1, 5 0, 0001 +129

Cl 123 4.2 -90

Sin embargo, habitualmente en la membrana celular no sólo se encuentran canales iónicos de paso del potasio, sino también canales para otros tipos de iones. Como se muestra en las Tablas 1 y 2, también existe un gradiente de concentración de membrana para estos iones. En consecuencia, también se puede calcular un determinado potencial de equilibrio para estos iones. En la Tabla 2 se muestran los potenciales de equilibrio de los iones más importantes. Por

ejemplo, el gradiente para los iones sodio es exactamente contrario al de los iones potasio. El potencial de equilibrio para el sodio, de +67mV, está claramente en el rango positivo.

La contribución de los diferentes gradientes iónicos al potencial de membrana en reposo de una célula permeable a los iones potasio, sodio y cloruro se describe mediante la ecuación de voltaje de Goldman-Hodgkin-Katz (Ecuación... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la identificación de la actividad agonista de un compuesto diana sobre un canal de potasio dependiente del voltaje, caracterizado porque a) se prepara una población de células que expresan dicho canal de potasio; b) se incuban las células de a) con un colorante fluorescente sensible al voltaje; c) se añade el compuesto diana a la mezcla de reacción de b) ; d) se determina un valor F1 de la intensidad de fluorescencia de las células; e) se añaden iones potasio en una concentración fisiológicamente compatible; f) se determina un valor F2 de la intensidad de fluorescencia de las células;

g) se compara la intensidad de fluorescencia F2 con la intensidad de fluorescencia F1 y se averigua la actividad agonista del compuesto diana sobre el canal de potasio.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la población de células que expresan un canal de potasio, expresan además un sensor de voltaje óptico fluorescente basado en proteínas, el paso b) se suprime y se añade el compuesto diana a la mezcla de reacción de a) .

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se selecciona el canal de potasio dependiente del voltaje de la familia de los canales KV.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el canal de potasio dependiente del voltaje de la familia de los canales Kv es un canal de la familia KV7.x o KCNQ.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la población de células que expresan el canal de potasio se selecciona de entre células transitorias transfectadas, líneas de células estables, cultivos de células primarias o células de tejido o células que expresan un canal de potasio de modo endógeno.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el colorante fluorescente es un colorante fluorescente sensible al voltaje.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el colorante fluorescente sensible al voltaje se selecciona entre colorantes lentos o rápidos, combinaciones de colorantes basados en FRET o sensores de voltaje ópticos fluorescentes basados en proteínas.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el colorante fluorescente sensible al voltaje es un colorante rápido sensible al voltaje seleccionado de entre colorantes de estirilo, colorantes de oxonol o colorantes de hemicianina.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el colorante sensible al voltaje es un colorante fluorescente sensible al voltaje lento seleccionado de entre Dis BAC2 (3) , Di BAC4 (3) , Di OC2 (3) , Dis C3 (3) , Dis C3 (5) , sistemas de colorantes basados en FRET que contienen Dis BAC2 (3) ó Dis BAC4 (3) y el fosfolípido unido a membrana cumarina CC2-DM PE o que contiene Dis BAC2 (3) /Dis BAC1 (5) , colorantes de carbocianina, colorantes de rodamina, colorantes de oxonol y bisoxonol o colorantes de merocianina.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el procedimiento está adaptado a una utilización con exploración de alto rendimiento.