IFN-beta sencillo fusionado a un fragmento Fc de lgG mutado.

Una proteína que comprende un IFN-beta sencillo fusionado a un dominio Fc de IgG mutado que contiene dos subunidades,

la primera subunidad comprende un brazo Fc de IgG mutado no ligado a una proteína IFN-beta, la segunda subunidad comprende un brazo Fc de IgG mutado ligado a una proteína IFN-beta sencilla, donde dicha primera subunidad consiste en el SEQ ID NO: 3 y dicha segunda subunidad consiste en el SEQ ID NO: 8.

IFN-beta sencillo fusionado a un fragmento Fc de IgG mutado Campo de la Invención La presente invención se refiere a un IFN-beta sencillo fusionado a un fragmento Fc de IgG mutado (denominado en lo sucesivo slFNbeta-lgGFcmut) , los nucleótidos que codifican el mismo, los vectores y vectores de expresión que comprenden el mismo, las células anfitrionas transformadas con el mismo y su uso como medicamento así como su uso en particular para tratar la esclerosis múltiple. El IFN-beta sencillo fusionado a un fragmento Fc de IgG mutado comprende dos subunidades, comprendiendo la primera subunidad un brazo Fc de IgG mutado no ligado a una proteína IFN-beta y comprendiendo la segunda subunidad un brazo Fc de IgG mutado ligado a una proteína IFNbeta sencilla.

Antecedentes de la Invención Se ha informado (véase Spiekermann GM et al. 2002) que las proteínas que comprenden el fragmento Fc de una inmunoglobulina (Ig) ligado a una proteína de interés, por ejemplo, Eritropoyetina (EPO) , permiten la administración inhalable, aparentemente a través de la unión al receptor de Fc relacionado con la clase I del MHC, FcRn, presente en los pulmones humanos adultos que reconoce, se une y acepta el fragmento Fc de las inmunoglobulinas. La fusión de una proteína a un fragmento Fc de inmunoglobulina permite que la proteína híbrida sea reconocida por el FcRn. El fragmento Fc de inmunoglobulina consiste en dos brazos idénticos que comprenden la región bisagra (H) y el segundo (CH2) y tercer (CH3) dominio de una cadena pesada de anticuerpo.

El FcRn es activo en tejido epitelial adulto (humano pero no de roedor) y se expresa en el lumen del intestino, las vías aéreas pulmonares, las superficies nasales, las superficies vaginales, las superficies del colon y el recto (Documento US 6.485.726) . Las proteínas que comprenden un compañero de unión de FcRn (por ejemplo, IgG, proteínas de fusión que contienen fragmentos Fc) pueden ser transportadas eficazmente a través de barreras epiteliales por los FcRn, proporcionando así un medio no invasivo para administrar sistémicamente una molécula terapéutica deseada.

Se sabe que el fragmento Fc, también llamado dominio Fc, de las inmunoglobulinas (p. ej. las IgG) es responsable de las denominadas funciones efectoras asociadas con la administración de una inmunoglobulina (IgG) o de una proteína de fusión que comprende dicho dominio Fc (IgGFc) . Tales funciones efectoras incluyen la citotoxicidad celular dependiente anticuerpos (ADCC) a través de interacciones con los receptores de Fc (FcγR) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediante la unión al componente 1q del complemento (C1q) .

Las isoformas de IgG ejercen diferentes niveles de funciones efectoras. La IgG1 y la lgG3 humanas tienen fuertes efectos ADCC y CDC, mientras que la lgG2 humana ejerce efectos ADCC y CDC débiles. La lgG4 humana despliega ADCC débil y ningún efecto CDC.

En la ADCC, la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, IgG) se une a los receptores de Fc (FcγR) sobre la superficie de las células efectoras inmunitarias tales como las asesinas naturales y los macrófagos, conduciendo a la fagocitosis o lisis de las células elegidas como diana.

En la CDC, el anticuerpo (por ejemplo, IgG) destruye las células elegidas como diana mediante la activación de la cascada del complemento en la superficie celular. Las isoformas de IgG ejercen diferentes niveles de funciones efectoras aumentando en el orden de lgG4 < lgG2 < IgG1 < IgG3.

Los interferones son secretados naturalmente por las células infectadas y se identificaron por primera vez en 1957. Su nombre deriva del hecho de que "interfieren" en la replicación y la producción viral. El interferón beta es un interferón bien conocido que se utiliza actualmente para tratar la esclerosis múltiple.

Se ha informado (documento WO 2005/001025) que los híbridos de dímero-monómero, con una molécula biológicamente activa, pero dos porciones de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, dos compañeros de unión de FcRn, funcionan y pueden ser transportados con mayor eficacia que los homodímeros, también denominados aquí simplemente como dímeros o multímeros de orden superior con dos o más copias de la molécula biológicamente activa. Los híbridos de monómero-dímero de interferón beta se describen en el documento WO 2005/001025. Un híbrido de monómero-dímero que comprende interferón beta humano fusionado con la región Fc de IgG1 humana se describe en el documento WO 2006/074199.

Compendio de la Invención En un primer aspecto, la invención proporciona un IFN-beta sencillo fusionado a un dominio Fc de IgG mutado (denominado en lo sucesivo slFNbeta-lgGFcmut) . El slFNbeta-lgGFcmut de la invención consiste en dos subunidades, la primera subunidad comprende un brazo Fc de IgG mutado no ligado (brazo Fcmut) a una proteína IFN-beta y la segunda subunidad comprende un brazo Fc de IgG mutado ligado a una proteína IFN-beta sencilla (brazo IFNbeta-Fcmut) donde dicha primera subunidad consiste en el SEQ ID NO: 3 y dicha segunda subunidad

consiste en el SEQ ID NO: 8. Las mutaciones introducidas dan como resultado una ADCC menor y una CDC menor. En una realización preferida, las mutaciones son L234A, L235E, G237A, A330S y P331S. En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido, p. ej. un ADN, que codifica un slFNbeta-lgGFcmut de acuerdo con la presente invención, los vectores y más concretamente los vectores de expresión que contienen dicho ADN.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula anfitriona, preferiblemente una célula CHO, que contiene, por ejemplo, como resultado de una transfección, un vector y en particular un vector de expresión de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un slFNbeta-lgGFcmut de acuerdo con la presente invención y su uso como un medicamento, en particular para tratar la esclerosis múltiple.

En otro aspecto, la invención describe el uso de un slFNbeta-lgGFcmut acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la leucemia de células pilosas, el sarcoma de Kaposi, la leucemia mielógena crónica, la esclerosis múltiple, la hepatitis A, la hepatitis B, la hepatitis C, el VIH y/o las infecciones causadas por virus seleccionados ente el virus de Epstein-Barr, el virus del herpes y/o el virus del papiloma.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para elaborar un slFNbeta-lgGFcmut acuerdo con la invención, el método que comprende cultivar una célula anfitriona, preferiblemente una célula CHO, de acuerdo con la invención y aislar el slFNbeta-lgGFcmut de acuerdo con la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a un IFN-beta sencillo fusionado a un dominio Fc de IgG mutado (denominado en lo sucesivo slFNbeta-lgGFcmut) que se puede liberar a través de absorción pulmonar, oral o subcutánea. El slFNbetalgGFcmut de la presente invención presenta funciones efectoras de Fc reducidas, buena actividad biológica, a la vez que todavía mantiene niveles en suero y vida media elevados en el sistema circulatorio.

En un primer aspecto, la invención describe un slFNbeta-lgGFcmut que contiene dos subunidades, comprendiendo la primera subunidad un brazo Fc de IgG mutado no ligado (brazo Fcmut) a una proteína IFN-beta y comprendiendo la segunda subunidad un brazo Fc de IgG mutado ligado a una proteína IFN-beta sencilla (brazo IFNbeta-Fcmut) donde el dominio Fc de IgG mutado (IgGFcmut) es un dominio Fc de inmunoglobulina gamma de (IgG) -1 donde al menos las posiciones 234, 235, 237, 330 y 331, de acuerdo con la posición del índice de EU como definen Kabat et al. (Kabat E. A. et al. 1991) , se han mutado. Las mutaciones introducidas dan como resultado una ADCC menor y una CDC menor. En una realización preferida, las mutaciones son L234A, L235E, G237A, A330S y P331S. Con el fin de evitar confusión en la numeración de las posiciones de las mutaciones, en la siguiente Tabla 1 se informa de una comparación entre las posiciones de los aminoácidos de algunos SEQ ID NO: de la invención y el índice de EU:

Tabla 1

Mutaciones SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, 5 SEQ ID NO: 8, 10 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 Índice de EU (Kabat)

L→A 117 14 180 14 188 234

L→E 118 15 181 15 189 235

G→A 120 17 183 17 191 237

A→S 213 110 276 110 284 330

P→S 214 111 277 111 285 331

N→A 180 77 243 77 251 297

En la población se encuentran diferentes alotipos de IgG1. La región constante pesada de IgG1 humana citada en el SEQ ID NO: 1 es el alotipo... [Seguir leyendo]

1. Una proteína que comprende un IFN-beta sencillo fusionado a un dominio Fc de IgG mutado que contiene dos subunidades, la primera subunidad comprende un brazo Fc de IgG mutado no ligado a una proteína IFN-beta, la segunda subunidad comprende un brazo Fc de IgG mutado ligado a una proteína IFN-beta sencilla, donde dicha primera subunidad consiste en el SEQ ID NO: 3 y dicha segunda subunidad consiste en el SEQ ID NO: 8.

2. Un polinucleótido que codifica una proteína de acuerdo con la reivindicación 1.

3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho polinucleótido comprende o consiste en el SEQ ID NO: 4 o el SEQ ID NO: 9.

4. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho polinucleótido comprende o consiste en el SEQ 10 ID NO: 12.

5. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Una célula anfitriona transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 5.

7. La célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha célula es una célula CHO.

8. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 1.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso como medicamento.

10. El uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

11. Un método para elaborar una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho método comprende 20 cultivar una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, y aislar dicha proteína.