Fragmentos de ácidos nucleicos y método de detección específico por identificación molecular de diferentes especies de bacterias del género acinetobacter.

Gen rpoB completo de una bacteria del género Acinetobacter seleccionada de entre las 23 especies siguientes:

A. calcoaceticus (especie genómica 1), especie genómica 3, A. haemolyticus (especie genómica 4), A. junii (especie genómica 5), especie genómica 6, A. johnsonii (especie genómica 7), A. lwoffii (especie genómica 8), especie genómica 9, especie genómica 10, especie genómica 11, A. radioresistens (especie genómica 12), especie genómica 13, especie genómica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias SEC ID no 9 y 11 a 32 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad, así como sus secuencias complementarias.

Fragmentos de acidos nucleicos y metodo de deteccion especifico por identificacion molecular de diferentes especies de bacterias del genero acinetobacter. La presente invencion se refiere al campo del diagnostico. Mas precisamente, la invencion se refiere a un metodo para la identificacion molecular de las bacterias del genero Acinetobacter mediante las tecnicas de amplificacion y secuenciacion de acidos nucleicos con la ayuda de cebadores oligonucleotidicos. Las bacterias del genero Acinetobacter son unas bacterias que aparecen en forma de cocobacilos Gram negativos, de crecimiento aerobio. Se reconocen actualmente aproximadamente 60 especies y 2 subespecies. Estas bacterias son esencialmente, pero no unicamente, unos agentes de infecciones nosocomiales. Su espectro comprende desde la simple colonizacion hasta infecciones que ponen en juego el pronostico vital, en particular las neumonias, infecciones urinarias, bacteriemias y meningitis (van Dessel et al., 2004) . Su excelente capacidad de supervivencia en el entorno exterior del hospital y su capacidad para desarrollar rapidamente resistencias a la mayoria de los antibioticos son los principales factores de su emergencia como agentes de infecciones nosocomiales, en particular en las unidades de cuidado intensivo (Bergogne-Berezin y Towner, 1996; Towner, 1997) . Aunque la mayoria de las especies sean responsables de infecciones en el ser humano, solo algunas especies han sido aisladas en el medio ambiente (Nemec et al., 2001, 2003; Carr et al., 2003) . Mientras que, en el genero Acinetobacter, se han propuesto 32 especies (van Dessel et al., 2004) , son reconocidas 24 especies genomicas (quot;genomic speciesquot; segun la nomenclatura en vigor y abreviados a continuacion quot;geno speciesquot; o quot;g.sp.quot;) y solo 17 especies tienen un nombre validado (Nemec et al., 2003; Carr et al., 2003) . Desafortunadamente, los miembros de este genero tienen una variabilidad fenotipica intra-especifica muy amplia, y no son por lo tanto diferenciables en el plano fenotipico. El aumento del numero de infecciones relacionadas con estos agentes ha estimulado la busqueda de metodos de analisis para la identificacion y la taxonomia de estas bacterias. Se ha demostrado tambien que los metodos de identificacion basados en los caracteres fenotipicos y la secuenciacion del gen del ARN 16S ribosomico por comparacion con la hibridacion ADN-ADN no eran validos. Asi, la busqueda de metodos de identificacion rapida de estas bacterias esta aun de actualidad (Gerner-Smidt et al., 1991; Ibrahim et al., 1997; Rainey et al., 1994) . En particular, las tecnicas moleculares basadas en la secuenciacion del gen de ARN 16S ribosomico no permiten distinguir las especies mas proximas, en particular debido a una falta de polimorfismo de este gen en este genero, (Yamamoto y Harayama, 1998; Ochman y Wilson, 1987; Stackebrandt y Goebel, 1994) . Ademas, debido a esta falta de polimorfismo, existe la necesidad de determinar la secuencia completa del gen 16S ARNr si se desea poder identificar una especie. Esto impone secuenciar la totalidad del gen que es aproximadamente de 1600 pares de bases. La consecuencia practica es que la secuenciacion debe apoyarse en un minimo de 6 reacciones de secuenciacion ademas de la reaccion de amplificacion para obtener un resultado evaluable. Se hicieron unos intentos de filogenias utilizando la comparacion de los genes gyrB (Yamamoto y Harayama, 1996; Yamamoto et al., 1999) y recA (Krawczyk et al., 2002) en alternativa al gen del ARN 16S ribosomico (Ibrahim et al., 1997) . Desafortunadamente, las secuencias de estos genes no se determinaron sobre las 10 especies mas recientes (Nemec et al., 2001, 2003; Carr et al., 2003) . Por lo tanto existe todavia una demanda de una herramienta de identificacion molecular de las bacterias de las especies del genero Acinetobacter, utilizable rutinariamente en laboratorio de bacteriologia, en particular con un gen suficientemente polimorfico, tal que la determinacion de una secuencia corta (menos de 500 pares de bases) con solo 1 reaccion de amplificacion y dos reacciones de secuencias sea identificable, es decir amplificable y secuenciable por la utilizacion de un solo juego de cebadores. Se ha demostrado descubierto y demostrado segun la presente invencion que

- el gen rpoB y las secuencias no codificantes que lo acotan, a saber

- las secuencias no codificantes en 5' entre las secuencias de los genes rp/L y rpoB (a continuacion

denominadas quot;spacer rplL-rpoBquot; o quot;fragmento intergenico rp/L-rpoBquot;) , y

- las secuencias no codificantes en 3' entre las secuencias de los genes rpoC y rpoB (a continuacion

denominadas quot;spacer rpoB-rpoCquot; o quot;fragmento intergenico rpoB-rpoCquot;, constituyen un marcador genetico que permite la deteccion y la identificacion especifica de la bacteria de cada especie del genero Acinetobacter y, en particular, las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1) ,

A. baumannii (especie genomica 2) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. jnnii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. Iwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. scbindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus.

Las especies genomicas 1 a 16 (quot;genomic speciesquot;) corresponden a cepas referenciadas en GENEBANK, a algunas (no 3, 6, 9, 10, 13 y 16) no se les han atribuido todavia ningun nombre.

Se han descubierto algunas zonas hipervariables entre las diferentes especies y, por lo tanto, especificas de cada especie, flanqueadas por unas secuencias conservadas entre las diferentes especies, que permiten aplicar un metodo de identificacion molecular de las diferentes especies de bacterias Acinetobacter por amplificacion, con la ayuda de cebadores seleccionados en las secuencias conservadas e hibridacion y/o secuenciacion de las secuencias especificas asi amplificadas.

Mas particularmente, la presente invencion se refiere a secuencias de acidos nucleicos especificas de cada especie del genero Acinetobacter citado anteriormente cuya secuencia nucleotidica es extraida del gen rpoB de dichas bacterias.

Segun Lazcano et al. [J. Mol. Evol. (1988) 27:365-376], lasARN polimerasas estan divididas en dos grupos segun su origen, uno constituido por las ARN polimerasas virales ARN- o ADN-dependientes, y el otro constituido por las ARN polimerasas ADN-dependientes de origen eucariota o procariota (archaebacterias y eubacterias) . Las ARN polimerasas ADN-dependientes eubacterianas estan caracterizadas por una constitucion multimerica simple y conservada denominadas quot;core enzymequot;, representada por aWW', u quot;holoenzimaquot;, representada por aWW'o [Yura e Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13:59-97]. Numerosos trabajos han puesto en evidencia el papel funcional, dentro del complejo enzimatico multimerico, de la sub-unidad W de la ARN polimerasa eubacteriana. Las ARN polimerasas archaebacteriana y eucariota presentan, por su parte, una estructura mas compleja que puede alcanzar una decena, incluso una treintena, de subunidades [Puhlet et al. Proc . Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:4569-4573].

Los genes que codifican las diferentes subunidades aWW'o de la ARN polimerasa ADN-dependiente en las eubacterias, respectivamente los genes rpoA, rpoB, rpoC y rpoD, estan clasificados en diferentes grupos que comprenden los genes que codifican para las proteinas constitutivas de las subunidades ribosomicas o para las enzimas implicadas en la replicacion y la reparacion del genoma [Yura y Yshihma, Ann. Rev. Genet. (1979) 13:5997]. Algunos autores han mostrado que las secuencias de los genes rpoB y rpoC podian ser utilizados a fin de construir unos arboles filogeneticos [Rowland et al. Biochem. Soc. Trans. (1992) 21:40S] que permiten separar las diferentes ramificaciones y sub-ramificaciones entre los reinos vivientes.

Antes de exponer con mayor detalle la invencion, se definen a continuacion diferentes terminos, utilizados en la descripcion y las reivindicaciones:

- por quot;acido nucleico extraido de bacteriasquot; se entiende en la presente memoria bien el acido nucleico total, o bien elADN genomico, o bien los ARN mensajeros, o bien incluso el ADN obtenido a partir de la transcripcion inversa de losARN mensajeros;

- un quot;fragmento nucleotidicoquot; o un quot;oligonucleotidoquot; son dos terminos sinonimos que designan una cadena de motivos nucleotidicos caracterizada por una secuencia informacional de los acidos nucleicos naturales (o eventualmente modificados) y susceptibles de hibridarse, como los acidos nucleicos naturales,... [Seguir leyendo]

1. Gen rpoB completo de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 23 especies siguientes:

A. calcoaceticus (especie genomica 1) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. lwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias SEC ID no 9 y 11 a 32 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad, asi como sus secuencias complementarias.

2. Gen rpoB completo de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre dichas 23 especies segun la reivindicacion 1, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID no 9 y 11 a 32, las secuencias inversas y las secuencias complementarias, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad con dichas secuencias.

3. Fragmento de gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 23 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. lwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias SEC ID no 33 y 35 a 56 respectivamente, y las secuencias SEC ID no 77 y 79 a 100 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

4. Fragmento del gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1) , A. baumannii (especie genomica 2) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. lwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID no 33 a 56 respectivamente y las secuencias SEC ID no 77 a 100 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad, y sus secuencias complementarias.

5. Fragmento intergenico que comprende una secuencia no codificante que bordea el gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1) , A. baumannii (especie genomica 2) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. lwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvu, caracterizado porque su secuencia comprende una secuencia seleccionada de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias SEC ID no 121 a 144 respectivamente, y las secuencias SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

6. Fragmento intergenico que comprende una secuencia no codificante que bordea el gen rpoB de una bacteria del genero Acinetobacter segun la reivindicacion 5, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID no 121 a 144 respectivamente y las secuencias SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad, y sus secuencias complementarias.

7. Fragmento segun una de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque consiste en un oligonucleotido que presenta una secuencia especifica de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes:

A. calcoaceticus (especie genomica 1) , A. baumannii (especie genomica 2) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. lwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii,

A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, caracterizado porque su secuencia consiste en una secuencia de por lo menos 18, preferentemente de 18 a 35, motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias seleccionadas de entre las secuencias tales como se describen en las secuencias:

-SEC ID no 33 a 56 respectivamente,

-SEC ID no 77 a 100 respectivamente,

-SEC ID no 121 a 144 respectivamente,

-SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y

-las secuencias que presentan por lo menos 98% de identidad y sus secuencias complementarias.

8. Utilizacion in vitro como sonda de especie de un fragmento del gen segun una de las reivindicaciones 3 a 6 o un oligonucleotido segun la reivindicacion 7.

9. Oligonucleotido caracterizado porque presenta una secuencia conservada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes:

A. calcoaceticus (especie genomica 1) , A. baumannii (especie genomica 2) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. lwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii,

A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvu, que comprende una secuencia de por lo menos 12, preferentemente de por lo menos 18 motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias seleccionadas de entre las secuencias tales como se han descrito en las secuencias SEC ID no 1 a 8 siguientes, sus secuencias complementarias:

-SEC ID no 1.

5. TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG-3',

-SEC ID no 2.

5. CMACACCYTTGTTMCCRTGA-3',

-SEC ID no 3.

5. GTGATAARATGGCBGGTCGT-3',

-SEC ID no 4.

5. CGBGCRTGCATYTTGTCRT-3',

-SEC ID no 5 :5'-GAAGARCTTAAGAMDAARCTTG-3'

-SEC ID no 6.

5. CGTTTCTTTTCGGTATATGAGT-3',

-SEC ID no 7.

5. GTTCTTTAGGTATCAACATTGAA-3',

-SEC ID no 8.

5. GACGCAAGACCAATACGRAT-3',

en las que:

-D representa A, G o T,

-Y representa C o T,

-B representa C, G o T,

-R representa A o G, y

-M representa A o C.

10.Mezcla de oligonucleotidos, caracterizada porque comprende una mezcla equimolar de oligonucleotidos tales como se definen en la reivindicacion 9, de secuencias diferentes que comprende por lo menos 12, preferentemente por lo menos 18 motivos nucleotidicos consecutivos incluidos en una de las secuencias SEC ID no 1 a 5 y 8 o los oligonucleotidos de secuencias complementarias.

11.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 8 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 1, o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

12.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizadaporque consisteen una mezcla equimolar de 16 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 2 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

13.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 6 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 3 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

14.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 24 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 4 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

15.Mezcla de oligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 24 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 5 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

16.Oligonucleotido segun la reivindicacion 9, caracterizado porque su secuencia consiste en la secuencia SEC ID no 6 o secuencia complementaria.

17.Oligonucleotido segun la reivindicacion 9, caracterizado porque su secuencia consiste en la secuencia SEC ID no 7 o una secuencia complementaria.

18.Mezcla deoligonucleotidossegun la reivindicacion 10, caracterizada porque consisteen una mezcla equimolar de 2 oligonucleotidos de secuencias diferentes que consiste en la secuencia SEC ID no 8 o unos oligonucleotidos de secuencias complementarias.

19.Utilizacioncomocebadordeamplificaciony/o dereacciondesecuenciaciondeunoligonucleotido ouna mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 9 a 18, para la deteccion por identificacion molecular de una bacteria de una de dichas especies del genero Acitenobacter.

20.Procedimiento de deteccion por identificacion molecular de una bacteria de una de las especies del genero Acitenobacter, caracterizado porque se utiliza:

- el gen rpoB completo de dicha bacteria segun la reivindicacion 1 o 2, o

- un fragmento del gen segun una de las reivindicaciones 3 a 6, y/o

- un oligonucleotido segun una de las reivindicaciones 7, 9, 16 o 17 o una mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10 a 15 o 18.

21.Procedimiento segun la reivindicacion 20, caracterizado porque se intenta detectar especificamente una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1) , A. baumannii (especie genomica 2) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. Iwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, procedimiento en el que:

1. se pone en contacto una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos acidos nucleicos de por lo menos tal bacteria, con por lo menos una sonda de especie que consiste en un oligonucleotido segun la reivindicacion 7 o un fragmento del gen segun una de las reivindicaciones 3 a 7, preferentemente un fragmento del gen que consiste respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre:

- SEC ID no 33 a 56 respectivamente,

- SEC ID no 77 a 100 respectivamente,

- SEC ID no 121 a 144 respectivamente,

- SEC ID no 165 a 188 respectivamente, y

- las secuencias que presentan por lo menos el 98% de identidad y sus secuencias inversas y secuencias complementarias, y

2. se determina la formacion o la ausencia de un complejo de hibridacion entre dicha sonda y los acidos nucleicos de la muestra, y se determina asi la presencia de dicha especie de Acinetobacter en la muestra si existe la formacion de un complejo de hibridacion.

22.Procedimiento segun la reivindicacion 20, caracterizado porque comprende las etapas en las que:

1. se ponen en contacto unos cebadores de amplificacion que comprenden dichas mezclas de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10 a 15 o 18, con una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos acidos nucleicos de por lo menos una de dicha bacteria del genero Acinetobacter, y se realiza una amplificacion de acidos nucleicos por reaccion de polimerizacion enzimatica que comprende:

- como cebador 5', por lo menos un oligonucleotido o una mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10, 11, 13, 15 y 17 que comprende una secuencia incluida en una de las secuencias SEC ID no 1, 3, 5, y 7, que consiste preferentemente en dicha secuencia SEC ID no 1, 3, 5, y 7 completa o las secuencias complementarias, y

- como cebador 3', por lo menos un oligonucleotido o mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10, 12, 14, 16, y 18 que comprende las secuencias incluidas en una de las secuencias SEC ID no 2, 4 6, y 8 respectivamente, que consiste preferentemente en dicha secuencia SED ID no 2, 4, 6, y 8 completa o respectivamente une secuencia complementaria.

2. y se determina la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion, y se determina asi la presencia o la ausencia de dicha bacteria en la muestra si un producto de amplificacion ha aparecido o no ha aparecido respectivamente.

23.Procedimiento segun la reivindicacion 22, caracterizado porque se intenta detectar una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1) , A. baumannii (especie genomica 2) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. lwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, y, en la etapa 2, se determina la presencia o la ausencia de la especie dada de una dicha bacteria efectuando las etapas en las que:

a) se realiza una reaccion de secuenciacion de un fragmento del gen amplificado con dichos cebadores, y

b) se compara la secuencia de dicho fragmento amplificado obtenido con la secuencia de un fragmento del gen de dicha bacteria que comprende respectivamente:

- dichas secuencias SEC ID no 33 a 56, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 1 y 2 respectivamente

- dichas secuencias SEC ID no 77 a 100, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 3 y 4 respectivamente, y

- dichas secuencias SEC ID no 121 a 144, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 5 y 6 respectivamente, y

- dichas secuencias SEC ID no 165 a 188, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 7 y 8 respectivamente.

24.Procedimiento segun la reivindicacion 22, caracterizado porque se intenta detectar una especie dada de una bacteria Acitenobacter seleccionada de entre las 24 especies siguientes: A. calcoaceticus (especie genomica 1) , A. baumannii (especie genomica 2) , especie genomica 3, A. haemolyticus (especie genomica 4) , A. junii (especie genomica 5) , especie genomica 6, A. johnsonii (especie genomica 7) , A. lwoffii (especie genomica 8) , especie genomica 9, especie genomica 10, especie genomica 11, A. radioresistens (especie genomica 12) , especie genomica 13, especie genomica 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii,

A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus, y, en la etapa 2, se determina la presencia o la ausencia de la especie dada de una dicha bacteria efectuando las etapas en las que:

a- se pone en contacto una muestra que contiene o que es susceptible de contener unos acidos nucleicos amplificados de por lo menos una de dicha bacteria, con por lo menos una sonda de especie que consiste en un fragmento del gen rpoB segun una de las reivindicaciones 3 a 6, o un oligonucleotido segun la reivindicacion 7, preferentemente un fragmento que consiste respectivamente en una de dicha secuencias seleccionadas de entre:

- SEC ID no 33 a 56 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEQ. ID. no 1 y 2 respectivamente

- SEC ID no 77 a 100 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 3 y 4 respectivamente, y

- SEC ID no 121 a 144 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 5 y 6 respectivamente, y

- SEC ID no 165 a 188 respectivamente, cuando dichos cebadores 5' y 3' son unos oligonucleotidos de secuencias incluidas en las secuencias SEC ID no 7 y 8 respectivamente, y

b- se determina la formacion o la ausencia de un complejo de hibridacion entre dicha sonda y los acidos nucleicos amplificados de la muestra, y se determina asi la presencia o la ausencia de dicha especie Acinetobacter en la muestra si existe la formacion o no de un complejo de hibridacion.

25.Procedimiento segun una de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque se realizan las etapas que comprenden:

1. una primera amplificacion del acido nucleico de dicha muestra con un par de cebadores 5' y 3' seleccionados de entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun las reivindicaciones 11 y 12, que comprende unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 1 y SEC ID no 2, que consiste preferentemente en dichas secuencias SEC ID no 1 y 2, o las secuencias complementarias, y

2. una primera determinacion de la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion o, llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 1 con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 33 a 56 respectivamente, y

-si en esta etapa 2 se determina la presencia de las especies A. grimontii o A. junii, se realiza ademas:

3a-una segunda reaccion de amplificacion con unos cebadores 5' y 3' seleccionados de entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun la reivindicacion 10 o las reivindicaciones 13 y 14, que comprenden unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 3 y SEC ID no 4, que consisten preferentemente en dichas secuencias SEC ID no 3 y 4, o las secuencias complementarias, y

4a-una determinacion de la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion o, llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 3a con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 77 a 100 respectivamente, o

- si en esta etapa 2 se determina la presencia de las especies A. baylii o especie genomica 11, se realiza ademas:

3b-una segunda reaccion de amplificacion con unos cebadores 5' y 3' seleccionados de entre dichas mezclas de oligonucleotidos segun las reivindicaciones 17 y 18, que comprenden unas secuencias incluidas respectivamente en las secuencias SEC ID no 7 y SEC ID no 8, que consisten preferentemente en dichas secuencias SEC ID no 7 y 8, o las secuencias complementarias, y

4b-una determinacion de la aparicion o la ausencia de un producto de amplificacion que comprende unos acidos nucleicos de por lo menos una dicha bacteria, por hibridacion o, llegado el caso, secuenciacion y comparacion de los amplificados obtenidos en la etapa 3b con los fragmentos que consisten respectivamente en una de dichas secuencias seleccionadas de entre SEC ID no 165 a 188 respectivamente.

26.Kit de diagnostico util en un procedimiento segun una de las reivindicaciones 20 a 25, caracterizado porque comprende por lo menos uno de dicho oligonucleotido segun una de las reivindicaciones 7, 9, 16 o 17 o un mezcla de oligonucleotidos segun una de las reivindicaciones 10 a 15 o 18 o un fragmento del gen segun una de las reivindicaciones 3 a 6, asi como, preferentemente, unos reactivos utiles en las reacciones de hibridaciones o reacciones de amplificacion o secuenciacion llegado el caso.