Formación estable y selectiva de triples hélices y dobles hélices de tipo Hoogsteen empleando ácidos nucleicos intercalantes con torsión (TINA) y procedimiento para la preparación de TINA.

Un monómero con apilamiento de bases flexible, con la estructura general **Fórmula**

en la que

- X es una unidad monómera de estructura principal de un oligonucleótido o de un análogo de oligonucleótido,

oPNA, o análogos de PNA y en donde X comprende alquilendiol,

- L es un enlazador que comprende una cadena de alquilo, una cadena de oxaalquilo, una cadena de azaalquilo,una cadena de tiaalquilo, un grupo carboxamida, un grupo tiocarboxamida, un grupo sulfonamida o combinacionesde los mismos y comprende de 0-60 átomos,

- I1 es un sistema de anillo aromático monocíclico o policíclico seleccionado entre el grupo que consiste en benceno,naftaleno, azuleno y sistemas de anillos heteroaromáticos bicíclicos,

- C es un conjugador seleccionado entre el grupo de alquilo de 1 a 12 carbonos, alquenilo de 2 a 12 carbonos, alquinilode 2 a 25 carbonos o diazo o combinaciones de los mismos con una longitud no superior a carbonos y/oátomos de nitrógeno,

- I2 se selecciona entre el grupo de sistemas de anillos bicíclicos aromáticos, sistemas de anillos tricíclicos aromáticos,sistemas de anillos tetracíclicos aromáticos, sistemas de anillos pentacíclicos aromáticos y análogos heteroaromáticosde los mismos y sustituciones de los mismos.

Formación estable y selectiva de triples hélices y dobles hélices de tipo Hoogsteen empleando ácidos nucleicos intercalantes con torsión (TINA) y procedimiento para la preparación de TINA

Compendio de la invención La invención se refiere al campo de los oligonucleótidos y de los oligonucleótidos modificados con propiedades mejoradas, tales como la capacidad de formar hebras de triple hélice y la idoneidad para detección, diagnóstico y/o tratamiento.

En particular, la presente invención proporciona un nuevo monómero con apilamiento flexible de bases que se puede incorporar en un oligonucleótido proporcionando oligonucleótidos formadores de triple hélice (TFOs) capaces de unirse específicamente a secuencias con ácidos nucleicos diana bicatenarios o monocatenarios para formar triples hélices con una estabilidad térmica muy elevada. Otros aspectos son métodos para sintetizar los TFOs, así como su uso en detección, diagnóstico y tratamiento.

Antecedentes de la invención En el documento WO2005083084 se han descrito seudonucleótidos intercalantes capaces de ser incorporados en la estructura principal de un oligonucleótido o un análogo de oligonucleótido. Los oligonucleótidos que comprenden los seudonucleótidos intercalantes tienen una capacidad reducida para formar triple hélice, pero tienen la capacidad de discriminar entre ADN y ARN, es decir, forman complejos más estables con ADN que con ARN.

Malakhov et al, 2004 (Eur. J. Org. Chem. 2004, 1298-1307) han descrito un monómero para ser incorporado en un oligonucleótido o en un análogo de oligonucleótido. El objetivo del estudio era proporcionar una base natural, es de

cir, una base promiscua que se pudiera encajar en una hélice de Watson-Crick en el lado opuesto a cualquiera de las bases de origen natural. No se han descrito estudios sobre la formación de triple hélice.

El reconocimiento específico de secuencias de ADN bicatenario (ADNbc) es un tema de gran interés en el desarrollo de herramientas basadas en oligonucleótidos en la biología molecular, la terapéutica y la bionanotecnología. Las triples hélices se forman cuando un oligonucleótido monocatenario formador de triple hélice (TFO) se une a un ADNbc

a través de interacciones específicas en el surco mayor y esto ha sido el objeto de una intensa investigación para el direccionamiento de genes. Esta estrategia permite el control transcripcional, la desactivación de genes y el tratamiento selectivo de secuencias de ADN genómico con el objetivo de formar genes mutados o recombinados.

La afinidad de la tercera hebra de los TFOs hacia sus dianas es generalmente problemática debido a que es preciso su reconocimiento por secuencias de homopurinas de ADNbc y la formación no favorable de bases triples de Hoogs30 teen C+·G-C sensibles al pH, en condiciones fisiológicas en el motivo de unión paralelo (pirimidina) . Durante la última década, se han dedicado muchos esfuerzos a modificar los TFOs para mejorar la afinidad de la unión con sus dianas, junto con el diseño de bases nucleotídicas de triple hélice que podrían aliviar la restricción de la secuencia del ADNbc. Los oligonucleótidos que poseen ácidos nucleicos modificados, tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , ácidos nucleicos bloqueados (LNA) , 2'-aminoetil-oligorribonucleótidos (2'-AE-RNA) y N3' - P5' fosforamida35 tos que inducen una afinidad de la unión incrementada, son algunos de los TFOs modificados químicamente con más éxito. La estabilización de las estructuras de triple hélice también se ha observado tras la adición de compuestos heterocíclicos (intercalantes) que a veces poseen una cadena lateral cargada positivamente en relación con la solución acuosa que contiene las tres secuencias de oligonucleótidos. También se ha observado que un agente intercalante unido covalentemente al extremo 3' o 5' de un TFO, llevó a una estabilización térmica de triples hélices paralelas en un intervalo de +3, 0 - +16, 1°C, dependiendo de la longitud del enlazador y del tipo de agente intercalante. Sin embargo, se ha prestado poca atención a los agentes intercalantes fijados covalentemente, insertados como una protuberancia en el centro del TFO.

Este diseño podría tener varias ventajas. En primer lugar, se requiere la síntesis de una sola fosforamidita de seudonucleótidos intercalantes en comparación con la síntesis de al menos cuatro monómeros de nucleótidos necesarios 45 para los ácidos nucleicos modificados en los azúcares. En segundo lugar, varias inserciones protuberantes de un monómero intercalante en la secuencia podrían aumentar considerablemente las estabilidades de la hélice doble y la triple hélice, en comparación con una sola inserción. Por otra parte, la diferencia estructural entre los modos de unión de Watson-Crick y Hoogsteen junto con la ausencia o la presencia de 2'-OH en el ADN y el ARN, proporcionan diferentes propiedades para los distintos tipos de hélices. Por lo tanto, se espera que las inserciones protuberantes 50 de un enlazador y la ruptura de la hélice con agentes intercalantes den lugar a propiedades únicas en hélices seleccionadas de forma apropiada. Esto ha llevado a oligonucleótidos modificados químicamente que podrían discriminar entre diferentes tipos de ácidos nucleicos monocatenarios.

Christensen et al. (Nucleic acids research, vol. 30, nº 22, 15 de Noviembre 2002, páginas 4918-25) y el documento WO03/051901 describen el seudonucleótido intercalante (IPN) fosforamidita de (S) -1-O- (4, 4'-dimetoxitrifenilmetil) -3

O- (1-pirenilmetil) glicerol que se inserta en oligonucleótidos para generar ácidos nucleicos intercalantes (INA) .

Además, Christensen et al. (Nucleic acids research, vol. 30, nº 22, 15 de Noviembre 2002, páginas 4918-25) descri

ben un método para la preparación de tales IPNs y el documento WO03/051901 describe que tales compuestos se pueden utilizar como moduladores de la transcripción.

Descripción detallada de la invención

Las inserciones protuberantes de (R) -1-O-[4- (1-pireniletinil) fenilmetil]glicerol en el centro de oligodesoxinucleótidos de homopirimidina (ácidos nucleicos intercalantes con torsión, TINA) obtenidas mediante la reacción de acoplamiento de Sonogashira postsintética conducen a una estabilidad térmica extraordinariamente elevada de las hélices triples y dobles de tipo Hoogsteen, mientras que las dobles hélices de tipo Watson-Crick con el mismo contenido en nucleótidos, están desestabilizadas.

En un primer aspecto, la presente descripción proporciona un monómero con apilamiento de bases flexible, con la estructura general:

X-L-I1-C-I2

en la que X es una unidad monómera de estructura principal que se puede incorporar en la estructura principal de un oligonucleótido o de un análogo de oligonucleótido, o PNA, o análogos de PNA, L es un enlazador, I1 es un primer agente intercalante que comprende al menos un sistema conjugado esencialmente plano, que es capaz de apilarse junto con bases nucleotídicas de ADN, ARN o análogos de los mismos, C es un conjugador e I2 es un segundo agente intercalante que comprende al menos un sistema conjugado esencialmente plano, que es capaz de apilarse junto con bases nucleotídicas de ADN, ARN o análogos de los mismos.

Un monómero con apilamiento de bases flexible consiste en al menos dos sistemas de agentes intercalantes I1 e I2 que están unidos por un conjugador C que proporciona la rigidez estructural necesaria y la flexibilidad de torsión. Este último se cree que es importante para ayudar a los agentes intercalantes a ajustarse ellos mismos en una posición apropiada dentro de la hélice de ácido nucleico.

En una realización preferida, la estructura principal X es capaz de ser incorporada en un oligonucleótido de ADN, ARN, HNA, MNA, ANA, LNA, CAN, INA, CeNA, TNA, (2'-NH) -TNA, (3'-NH) -TNA, a-L-Ribo-LNA, a-L-Xilo-LNA, º-DRibo-LNA, º-D-Xilo-LNA, [3.2.1]-LNA, Biciclo-ADN, 6-Amino-Biciclo-ADN, 5-epi-Biciclo-ADN, a-Biciclo-ADN, Triciclo-ADN, Biciclo[4.3.0]-ADN, Biciclo[3.2.1]-ADN, Biciclo[4.3.0]amida-ADN, º-D-Ribopiranosil-NA, a-L-Lixopiranosil-NA, 2'-R-ARN, 2'-OR-ARN, 2'-AE-ARN, a-L-ARN, º-D-ARN, y combinaciones y modificaciones de los mismos.

Los ácidos nucleicos y sus análogos proporcionan un oligonucleótido que es capaz de unirse a ácidos nucleicos complementarios a través del apareamiento de bases de Watson-Crick o de Hoogsteen o Hoogsteen inverso. X se puede incorporar en el extremo 3' y/o en el extremo 5' y/o en el centro de las secuencias. Las bases nucleotídicas modificadas, hidratos de carbono, cadenas peptídicas, perlas magnéticas, perlas de agarosa, perlas de sefarosa, vidrio, superficies de plástico, metales pesados y superficies... [Seguir leyendo]

1. Un monómero con apilamiento de bases flexible, con la estructura general

X -L-I1 - C - I2

en la que - X es una unidad monómera de estructura principal de un oligonucleótido o de un análogo de oligonucleótido, o PNA, o análogos de PNA y en donde X comprende alquilendiol,

- L es un enlazador que comprende una cadena de alquilo, una cadena de oxaalquilo, una cadena de azaalquilo, una cadena de tiaalquilo, un grupo carboxamida, un grupo tiocarboxamida, un grupo sulfonamida o combinaciones de los mismos y comprende de 0-60 átomos,

- I1 es un sistema de anillo aromático monocíclico o policíclico seleccionado entre el grupo que consiste en benceno, naftaleno, azuleno y sistemas de anillos heteroaromáticos bicíclicos,

- C es un conjugador seleccionado entre el grupo de alquilo de 1 a 12 carbonos, alquenilo de 2 a 12 carbonos, alquinilo de 2 a 25 carbonos o diazo o combinaciones de los mismos con una longitud no superior a 25 carbonos y/o átomos de nitrógeno,

- I2 se selecciona entre el grupo de sistemas de anillos bicíclicos aromáticos, sistemas de anillos tricíclicos aromáticos, sistemas de anillos tetracíclicos aromáticos, sistemas de anillos pentacíclicos aromáticos y análogos heteroaromáticos de los mismos y sustituciones de los mismos.

2. El monómero con apilamiento de bases flexible según la reivindicación 1, en donde la unidad de longitud de la unidad monómera de estructura principal X que incluye un átomo de fósforo es menor de 6 átomos, en donde la 20 longitud de la unidad de la estructura principal es la distancia más corta desde un monómero al siguiente.

3. El monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el alquilendiol de X es etilenglicol o 1-O-metilenglicerol que opcionalmente tiene el alquilendiol comprendido en parte en un sistema de anillo, tal como glicona.

4. El monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en 25 donde el alquilendiol de X es etilenglicol.

5. El monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el alquinilo de C es acetileno o acetilenos repetitivos.

6. Un monómero con apilamiento de bases flexible según la reivindicación 1, en donde C se selecciona entre

el grupo que consiste en anillos aromáticos de cadena lineal o de cadena ramificada o monocíclicos y sustituciones 30 de los mismos.

7. Un monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la longitud de L es de al menos 2 átomos.

8. El monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde I1 es benceno.

9. El monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde I2 es pireno.

10. El monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de fórmula en donde R es ariletinilo.

11. El monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes,

adaptado para ser incorporado en un oligonucleótido, en donde dicho monómero se selecciona entre el grupo de una fosforamidita, una fosfordiamidita, un fosfordiéster, un fosfortriester, un fosfonato, un H-fosfonato, un fosfito, un clorofosfito, una clorofosforamidita, una fosfonamidita, una fosfoncloridita, un trifosfato, un difosfato.

12. Un oligonucleótido que comprende el monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. Un método para la preparación de un monómero con apilamiento de bases flexible según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende las etapas de

a. proporcionar un precursor de un monómero con apilamiento de bases flexible, en donde dicho precursor es un monómero con apilamiento de bases flexible que comprende I1 sustituido con un halógeno o sustituido con C o sustituido con azida,

b. reemplazar el halógeno o el sustituyente C o el sustituyente azida del precursor de la etapa a con C - I2

c. hacer que el precursor sustituido con C - I2 de un monómero con apilamiento de bases flexible sea adaptable para ser incorporado en un oligonucleótido.

14. Un método para la preparación de un oligonucleótido según la reivindicación 12, que comprende las etapas de:

a. proporcionar un monómero con apilamiento de bases flexible adaptado para ser incorporado en un oligonucleótido

b. proporcionar reactivos convencionales para la síntesis de un oligonucleótido

c. durante la síntesis del oligonucleótido incorporar uno o varios monómeros con apilamiento de bases flexibles en el oligonucleótido

d. generando de este modo un oligonucleótido que comprende un monómero flexible de estructura principal.

15. Un método para la preparación de un oligonucleótido según la reivindicación 12, que comprende las etapas de:

a. proporcionar un precursor de un monómero flexible, adaptado para ser incorporado en un oligonucleótido, en donde dicho precursor es un monómero con apilamiento de bases flexible que comprende I1 sustituido con un halógeno o sustituido con C o sustituido con azida.

b. proporcionar reactivos convencionales para la síntesis del oligonucleótido

c. durante la síntesis del oligonucleótido incorporar uno o varios precursores de los monómeros con apilamiento de bases flexibles en el oligonucleótido

d. después de la síntesis del oligonucleótido, el sustituyente halógeno o el sustituyente C o el sustituyente azida en I1 se sustituye con C - I2

e. generando de este modo un oligonucleótido que comprende un monómero con apilamiento de bases flexibles.

16. Uso del oligonucleótido según la reivindicación 12, para la formación de una estructura de ácido nucleico bicatenaria o una estructura de ácido nucleico de triple hélice.

17. Un método para formar ácidos nucleicos bicatenarios o ácidos nucleicos de triple hélice que comprende las etapas:

a. proporcionar un oligonucleótido según la reivindicación 12

b. proporcionar un ácido nucleico monocatenario o bicatenario

c. incubar el oligonucleótido de la etapa a con el ácido nucleico diana monocatenario o bicatenario de la etapa b en condiciones de formación de una doble hélice o triple hélice

d. formando de este modo una estructura de ácido nucleico bicatenario o de ácido nucleico de triple hélice.

18. Un método según la reivindicación 17, en el que la formación de una estructura de ácido nucleico bicatenario o de triple hélice se utiliza para la modulación específica de secuencia de la actividad de un ácido nucleico diana.

19. Un método según la reivindicación 17, en el que la formación de una estructura de ácido nucleico bicatenario o de triple hélice se utiliza para la detección específica de secuencia del ácido nucleico diana.

20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, en donde el ácido nucleico diana se selecciona entre el grupo de un gen cromosómico, un ARNm, un ARNr, un ARNt y un ARNmicro.

21. El oligonucleótido según la reivindicación 12, para uso como un medicamento.

22. Uso del oligonucleótido según la reivindicación 12, para la preparación de un medicamento.