Exposición de pIX en fagos independiente de secuencia de señal.

Un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína pIX de fusiónprocedente de un fago filamentoso,

en el que la proteína de fusión no comprende una secuencia de señal de N-terminal de procariota.

Exposición de pIX en fagos independiente de secuencia de señal

Antecedentes de la invención El uso de enfoques combinatorios para la identificación de proteínas, su caracterización y modificación, ha tenido un gran éxito tanto en la investigación académica como en el desarrollo comercial. A este respecto, la tecnología de exposición en bacteriófagos filamentosos, o fagos, ha allanado el camino, por ser la primera plataforma de biblioteca y, aún, reinar como tecnología dominante. De este modo, la exposición en fagos se aplica ampliamente tanto en el descubrimiento de proteínas básicas como en el de proteínas aplicadas, así como en el desarrollo tanto de los nuevos diagnósticos basados en proteínas como en el terapéutico, que son la clase de compuestos de más rápido crecimiento en todo el mundo.

El principio de la tecnología combinatoria de exposición en fagos se basa en la vinculación genotipo-fenotipo ofrecida por la propiedad de que cada virión sólo expondrá visualmente en su superficie las mismas auténticas proteínas que son codificadas por el genoma encapsulado por su capa de proteína. La propia partícula de fago es muy resistente a una variedad de condiciones fisicoquímicas; por lo tanto, la exposición en fagos ofrece una versatilidad superior en muchos regímenes de selección en comparación con las tecnologías combinatorias que compiten con aquél.

La exposición en fagos de polipéptidos heterólogos se ha logrado usando las cinco proteínas estructurales de la cubierta del fago filamentoso, pero sólo la exposición de la pIII-y, en cierta medida, la de la pVIII-han ganado uso generalizado (véase la figura 1) .

Cuando la fusión heteróloga es sólo un péptido corto, se prefieren los sistemas de exposición multivalentes que usan vectores basados en genoma de fagos, mientras que, para las fusiones más grandes, que requieren dominios plegados, la mayoría de las aplicaciones se beneficiarán de los sistemas de fagémido. En este último caso, la exposición en fagos de anticuerpos pIII es, con mucho, la que domina el campo, pero van saliendo a la luz andamiajes alternativos, que alimentan la necesidad de expansión de las herramientas de ingeniería de proteínas para el mañana. Una aplicación muy deseada consiste en obtener efectivamente un péptido de alta afinidad específica o aglutinantes de proteínas a partir de una biblioteca de exposiciones en fagos simplemente mediante la infección de bacterias con viriones de fagos cuando todavía están unidos a su objetivo.

Endemann y Model, 1995 (PMID: 7616570) , informó de que la cubierta menor de pIX no era funcional con otra proteína fusionada con su N-terminal. Por lo tanto, este informe concluía que pIX no se puede usar para la exposición en fagos.

Tanto Gao et al. (PMID: 10339535, 12239343 y WO 0071694) como Khalil et al. (PMID: 17360403) han demostrado más tarde que la exposición de fusión de pIX de N-terminal se permite cuando se expresa a partir de fagémidos y se usa en combinación con orientación periplásmica dependiente de secuencia de señal. En estos sistemas, la complementación tiene lugar cuando la wt pIX es donada desde el genoma del fago auxiliar sobre el rescate de fagémido.

El fagémido, como se describe en la figura 2A del documento WO 0071694 (sin proteína de fusión insertada) y en la figura 2B del documento WO 0071694 (con proteína de fusión insertada) , comprende claramente una secuencia de señal pelB (con el texto de la figura en la página 7, líneas 2-14) .

Como se mencionó anteriormente, había sido sugerido previamente que pIX no era funcional con otra proteína fusionada con el extremo N-terminal, y Gao et. al. dio dos posibles razones de su éxito, ya fuera por sí solo o por la combinación de ambos.

Una posible razón era que una secuencia líder procariota (secuencia de señal) se unía al N-terminal de las proteínas de fusión, asegurando, de este modo, la orientación de la proteína recombinante al espacio periplásmico, y, por ello,

prevenía la acumulación en el citoplasma.

Otra posible razón era que las proteínas recombinantes fueran expresadas desde un fagémido, no desde un genoma de fago, como en Endemann y Model; por lo tanto, un pIX de tipo salvaje del fago auxiliar necesitaba inevitablemente que un rescate de fagémido fuera complementando las proteínas recombinantes pIX de fusión, preservando, de este modo, la funcionalidad de tipo salvaje que, de otro modo, podría haber perdido debido a la modificación recombinante. Es decir, los fagos comprenderían una mezcla de proteínas de tipo salvaje y de fusión.

Khalil et al. (PMID: 17360403) describe una aplicación que explota la característica de un virión de fago filamentoso biespecífico en el que se expone un péptido exógeno en cada punta distal del mismo virión. Esto se logró usando 65 una combinación de un vector de genoma de fago pIII común complementando a un fagémido procariota de exposición de pIX dependiente de secuencia de señal. En esta configuración, el vector genoma de fago sirvió como fago auxiliar en el rescate del fagémido.

Sumario de la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar un andamiaje alternativo para péptidos expuestos en fagos filamentosos.

Un primer aspecto de la invención es el de unas proteínas pIX de fusión que se originan en un fago filamentoso, dichas proteínas de fusión no comprenden una secuencia de señal de N-terminal de procariota y, por lo tanto, es una fusión directa con un péptido exógeno.

Otro aspecto de la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de la invención.

Un aspecto de la invención se refiere a fagos filamentosos que comprenden las proteínas de fusión de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a una biblioteca de fagos filamentosos.

Otro aspecto de la invención se refiere a un sistema de exposición en fagos que comprende un fagémido y un fago auxiliar, en el que el fagémido comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas pIX de fusión de la invención.

Un aspecto se refiere a un estuche que comprende un sistema de exposición en fagos y un fago auxiliar, en el que el fagémido comprende un ácido nucleico que codifica las proteínas pIX de fusión de la invención.

Breve descripción de las figuras Figura 1. Dibujo esquemático de la estructura de un fago filamentoso. El virión está constituido por cinco proteínas estructurales que recubren una molécula de cadena sencilla de ADN. En el fago de tipo salvaje (wt) hay alrededor de 2.700 copias de pVIII y aproximadamente 3-5 copias de cualquiera de las cuatro proteínas pIII, pVI, pVII y pIX, que se encuentran en cada punta del virión. El tamaño del virión depende del tamaño del genoma en aproximadamente 2, 3 nucleótidos por proteína de pVIII de la cubierta y, de este modo, la longitud de la partícula se acomoda a un aumento o disminución de las copias insertadas de pVIII. De manera notable, las estructuras de pIII y pVIII se han caracterizado por difracción de fibra por rayos X, cristalografía y RMN. La proteína de capa menor de pIII contiene tres dominios distintos, separados por regiones ricas en glicina: N1 (que se une a ToIA) , N2 (que se une al pilus F) y CT (que, integrado en el virión, es importante para el montaje normal del virión) .

Figura 2. Dibujos esquemáticos de los nuevos fagémidos pGALD9 (A) y pGALD97!L (B) de exposición de pIX. La columna vertebral del vector de ambos fagémidos se basa en el fagémido pSEX81 (SEC ID N º: 2) de exposición de pIII, a cuya secuencia se puede acceder desde el acceso de GenBank Nº: Y14584, y cuyos detalles sobre la construcción se describen en Material and Methods. Ambos fagémidos pueden acomodar segmentos de secuencias exógenas en marco (denominados E1 y E2) a través de un fácil intercambio de casetes de las porciones de NcoI/HindIII y MluI/NotI, respectivamente. Los casetes están conectados por una secuencia de enlazador sintético que varía entre las diferentes construcciones descritas en este documento. Abreviaturas: lacPO, promotor lac; sd, secuencia de Shine-Dalgarno; pelB, secuencia de señal de pectato liasa bacteriana; TP, sitio de proteasa tripsina; t, T7 terminador de la transcripción.

Figura 3. Títulos de fagémidos de (A) scFv anti-phOx (SEC ID Nº: 11) y (C) scFv anti-NIP expuestos a partir de pGALD9!L, pGALD9, pSEX81. Todos los fagémidos albergan un marcador de resistencia a ampicilina; por lo tanto, los títulos se muestran como unidades de formación de colonia resistente a la ampicilina por mililitro de solución (cfuampR/ml) . La relación entre fagémido y fago auxiliar de (B) scFv anti-phOx (SEQ... [Seguir leyendo]

1. Un genoma de fago o un fagémido que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína pIX de fusión procedente de un fago filamentoso, en el que la proteína de fusión no comprende una secuencia de señal de N5 terminal de procariota.

2. El genoma de fago o el fagémido de la reivindicación 1, en el que la proteína pIX de fusión comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la posición 1-32, 2-32, 3-32, 4-32 y 5-32 de la SEC ID Nº: 1 (MSVLVYSFASFVLGWCLRSGI-TYFTRLMETSS) .

3. El genoma de fago o el fagémido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el péptido exógeno está fusionado directamente con el extremo N-terminal de la secuencia de pIX.

4. El genoma de fago o el fagémido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el péptido exógeno

se selecciona de entre el grupo que consiste en anticuerpos o fragmentos de ellos, que cubre Fv, scFv, Fab, dominios individuales, dominio Z de la proteína A o fragmentos de él (affibody) , ankyrin o fragmentos de ella, DARPin o fragmentos de ella, receptor de células T o fragmentos de él, CMH de clase I o II o fragmentos de él, fibronectina o fragmentos de ella, Anticalins o fragmentos de ellas, dominios PDZ o fragmentos de ellos, IgNAR o fragmentos de él, CTLA4 o fragmentos de él, ImmE7 o fragmentos de ella, knottins o fragmentos de ellos, avimer o fragmentos de ella, GFP o fragmentos de ella y otros fluoróforos biológicos codificados por genes.

5. El genoma de fago o el fagémido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el péptido exógeno es un miembro de la biblioteca.

6. Un fago filamentoso que comprende un genoma de fago o un fagémido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El fago filamentoso de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende adicionalmente un gen que codifica wt pIX

y/o proteína de wt pIX. 30

8. El fago filamentoso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el fago no comprende un gen que codifica wt pIX y/o proteína de wt pIX.

9. El fago filamentoso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende adicionalmente uno o

más del grupo seleccionado a partir de la proteína pIII de fusión, de la proteína pVII de fusión y de la proteína pVIII de fusión.

10. Un sistema de exposición en fagos que comprende un genoma de fago o un fagémido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un fago auxiliar. 40

11. Un estuche que comprende el sistema de exposición en fagos de la reivindicación 10.

12. Una biblioteca de fagos que comprende dos o más fagos filamentosos que exponen diferentes proteínas, en la

que al menos una de estas proteínas es la proteína pIX de fusión expresada a partir del genoma de fago o de un 45 fagémido de acuerdo con la reivindicación 1.