Enzimas y complejos de ácidos nucleicos y métodos para su uso.

Uso de una enzima de ácidos nucleicos multi-componente con actividad ligasa (MNAzima ligasa) para ligar dossustratos en el que dichos sustratos son ligados por dicha MNAzima ligasa sólo en presencia de un facilitador delensamblaje de la MNAzima,

para formar un producto después del reclutamiento de dichos sustratos por los brazosde sustrato de dicha MNAzima ligasa, en el que dicho producto se asocia con los componentes de al menos uncomplejo de ácidos nucleicos.

Enzimas y complejos de ácidos nucleicos y métodos para su uso Campo Técnico La presente invención se refiere a métodos que utilizan complejos de ácidos nucleicos multi-componente (MNA) . Los complejos MNA pueden ser enzimas activas (por ejemplo, MNAzimas incluyendo apta-MNAzimas) con actividad modificadora tal como actividad ligasa o de escisión. Además, la invención se refiere a cascadas que usan MNAzimas y también pueden incluir una o más ADNzimas. La invención también se refiere a métodos que usan estas cascadas para la identificación, detección y cuantificación de dianas.

Antecedentes de la Invención Varias publicaciones, que pueden incluir patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y artículos especializados, se citan a lo largo de esta especificación en paréntesis, y las citaciones completas de cada uno pueden encontrarse al final de la especificación.

Además de sus funciones evolutivas optimizadas, las propiedades físicas y funcionales extraordinarias de los ácidos nucleicos proporcionan la oportunidad de una plétora de nuevos dispositivos y métodos biomoleculares. Los ácidos nucleicos de diseño se han contemplado para entidades terapéuticas, biosensores, dispositivos a nano-escala y herramientas para la computación molecular. Los métodos explotan las características del ADN respecto a autoensamblaje, electro-conductividad, elementos de información, amplificación, cambio, detección molecular y actividad catalítica. Además, como el ADN es robusto, estable y termoestable, proporciona un material ideal para la ingeniería molecular de dispositivos mecánicos o computacionales.

Los ácidos nucleicos monocatenarios, tales como ADN y ARN, tienen la capacidad de plegarse en estructuras tridimensionales complejas que pueden funcionar como receptores altamente específicos (por ejemplo, aptámeros) y catalizadores (por ejemplo, ribozimas, ADNzimas) . Además, el requerimiento de complementariedad entre las cadenas de ácido nucleico para la hibridación forma la base para un amplio rango de técnicas, que permiten la detección de dianas (por ejemplo, análisis con micromatrices, transferencia Northern o transferencia Southern) , y/o la amplificación de dianas (por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa) . Además, la hibridación proporciona la base para la construcción a nano-escala de ácidos nucleicos y para las estrategias computacionales basadas en ADN.

En los últimos 20 años se ha descubierto una amplia variedad de moléculas de ácido nucleico, con actividad enzimática o catalítica. Las enzimas de ARN (quot;ribozimasquot;) aparecen en la naturaleza pero pueden prepararse por ingeniería para reconocer y modificar específicamente un sustrato de ARN diana (Haseloff y Gerlach, 1988) . Las técnicas de desarrollo in vitro han facilitado el descubrimiento y desarrollo de muchos más ácidos nucleicos catalíticos, incluyendo ácidos desoxirribonucleicos frecuentemente referidos como quot;enzimas de ADNquot; o quot;ADNzimasquot; (revisado Emillson y Breaker, 2002) . Se han descubierto ADNzimas y/o ribozimas desarrolladas in vitro que tienen la capacidad de catalizar un rango extenso de reacciones incluyendo, pero no limitado a, escisión de ácidos nucleicos, ligación de ácidos nucleicos, fosforilación de ácidos nucleicos, adición de una cubierta a los ácidos nucleicos, adenilación de aminoácidos, síntesis de cofactor, polimerización de ARN, polimerización dirigida por molde, conjugación ARN-proteína, reacción de aldol, oxidación de alcohol, reducción de aldehído, síntesis de nucleótidos de purina y pirimidina, alquilación, síntesis de amida, síntesis de urea, formación de enlaces peptídicos, síntesis de peptidil-ARN, transferencia de acilo, aminoacilación, hidrólisis de carbonato, alquilación de fósforotioato, metalación de porfirina, formación de enlaces carbono-carbono, formación de nanopartículas de Pd, isomerización de bifenilo, formación de enlaces éster, formación de enlaces amida, desglicosilación de ADN, fotoreversión de dímeros de timina o escisión fosforamidato (revisado Silverman, 2007)

En particular, se han caracterizado ADNzimas y ribozimas que escinden específicamente distintas secuencias de ácidos nucleicos después de hibridar mediante emparejamiento de bases de Watson Crick. Las ADNzimas son capaces de escindir bien moléculas de ARN (Breaker y Joyce, 1994; Santoro y Joyce, 1997; Santoro y Joyce, 1998)

o ADN (Carmi et al., 1996) . Las ribozimas también son capaces de escindir secuencias diana tanto de ARN (Haseloff y Gerlach, 1988) como de ADN (Raillard y Joyce, 1996) .

Las ADNzimas quot;10:23quot; y quot;8:17quot; son capaces de escindir sustratos de ácido nucleico en enlaces fosfodiéster de ARN específicos. Estas ADNzimas escinden las uniones fosfodiéster nativas 3'-5' para crear productos de reacción que tienen grupos fosfato cíclico 2', 3' e hidroxilo 5' (Santoro y Joyce, 1997; revisado Emilsson y Breaker, 2002) .

También se han caracterizado ADNzimas que ligan específicamente distintas secuencias de ácido nucleico después de hibridar con dos ácidos nucleicos sustrato independientes. Las desoxiribozimas específicas (ADNzimas) pueden ligar productos fosfato cíclico 2', 3' e hidroxilo 5' y crear uniones 2'-5' no nativas. Los ejemplos de dichas ADNzimas incluyen las ligasas quot;7Z81quot; y quot;7Z48quot; (Prior et al, 2004) así como la ADNzima ligasa quot;7Q10quot; (Flynn-Charlebois et al, 2003) Se han descrito otras ADNzimas (Coppins y Silverman, 2004) que pueden ligar productos diol 2', 3' y 5'trifosfato y crear uniones 3'-5' nativas. Tabhor et al. (2006) produjeron una ligasa desoxiribozima binaria por ingeniería fusionando dos dominios catalíticos a través de una estructura tallo común.

Varios ácidos nucleicos catalíticos tienen estructuras básicas similares con múltiples dominios incluyendo un dominio catalítico conservado (quot;núcleo catalíticoquot;) flanqueado por dos dominios de unión a sustrato no conservados (quot;brazosquot;) , que reconocen y se hibridan específicamente con el sustrato. Los ejemplos de ácidos nucleicos con esta estructura básica incluyen, pero no están limitados a, la ribozima de cabeza de martillo, las ADNzimas 10:23 y 8:17, las ADNzimas ligasas quot;7Z81quot;, quot;7Z48quot; y quot;7Q10quot;, la ADNzima quot;UV1Cquot; de fotoreversión de dímeros de timina y la ADNzima quot;DAB22quot; formadora de enlaces carbono-carbono. Hasta la fecha, los ácidos nucleicos catalíticos son típicamente uni-moleculares aunque se conocen ejemplos de ácidos nucleicos catalíticos con más de un componente pero éstos requieren una procesamiento por ingeniería extenso (Tabor et al, 2006, Kurata et al, 2000) .

Se ha mostrado que los ácidos nucleicos catalíticos sólo toleran determinadas modificaciones en el área que forma el núcleo catalítico (Perreault et al., 1990; Perreault et al., 1991; Zaborowska et al., 2002; Cruz et al., 2004; Silverman, 2004) . Dependiendo de la astringencia de las condiciones de reacción, puede tolerarse algún grado de emparejamiento erróneo en los brazos del sustrato. Sin embargo, el requerimiento para el emparejamiento de bases de Watson Crick es lo suficientemente estricto como para haber permitido el desarrollo de protocolos que usan ácidos nucleicos catalíticos para facilitar la discriminación de secuencias muy relacionadas (Cairns et al., 2000) (WO 99/50452) .

Las tecnologías de amplificación y detección de dianas, tales como PCR, se han usado ampliamente en investigación y/o diagnóstico clínico. Sin embargo, a pesar de su potencia, cada una tiene desventajas inherentes. Todas requieren el uso de enzimas proteicas (por ejemplo, ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa y/o ligasa) . La inclusión de enzimas proteicas incrementa la complejidad y coste de la fabricación de los reactivos y disminuye la vida a temperatura ambiente de los kits que contienen los reactivos. Otros retos técnicos asociados incluyen la contaminación por replicones (amplicones diana) de reacciones previas que da lugar a una señal de falso positivo y/o señal de fondo causada por la replicación de secuencias de cebador (dímeros de cebador) o fondo causada por la ligación independiente de diana.

Las enzimas de ácidos nucleicos y las cascadas de enzimas de ácidos nucleicos se han considerado para un rango de aplicaciones biotecnológicas, especialmente en diagnóstico. Podrían permitir la detección de proteínas y ácidos nucleicos para el diagnóstico de enfermedades facilitando la amplificación de la señal.

Varios grupos han indicado el uso de ácidos nucleicos catalíticos para la detección de dianas de ácido nucleico y otros análisis con lecturas colorimétricas (Elghanian et al., 1997,... [Seguir leyendo]

1. Uso de una enzima de ácidos nucleicos multi-componente con actividad ligasa (MNAzima ligasa) para ligar dos sustratos en el que dichos sustratos son ligados por dicha MNAzima ligasa sólo en presencia de un facilitador del ensamblaje de la MNAzima, para formar un producto después del reclutamiento de dichos sustratos por los brazos de sustrato de dicha MNAzima ligasa, en el que dicho producto se asocia con los componentes de al menos un complejo de ácidos nucleicos.

2. El uso de la reivindicación 1 en el que dicho producto se selecciona del grupo que consiste en un facilitador del ensamblaje, partzima, sustrato, ADNzima, brazo estabilizador, inhibidor de la actividad, inhibidor del ensamblaje, o componente de éstos.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2 en el que el producto puede participar en una cascada.

4. El uso de la reivindicación 1 en el que al menos un sustrato es el producto de una reacción catalizada por una enzima de ácidos nucleicos.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho producto es un componente de una MNAzima.