Detección múltiplex de ácidos nucleicos.

Un método de captura de un marcador de un ácido nucleico de interés,

método que comprende:

a) proporcionar m extensores marcadores, en donde m es por lo menos dos, en donde los m extensoresmarcadores son capaces de hibridarse con el ácido nucleico de interés;

b) proporcionar un sistema de sistema de sonda marcadora que comprende el marcador, en donde uncomponente del sistema de sonda marcadora es capaz de hibridarse simultáneamente con por lo menos dosde los m extensores marcadores, donde cada uno de los por lo menos dos extensores marcadores comprendeuna secuencia de polinucleótidos L-1 que es complementaria de una secuencia de polinucleótidos del ácidonucleico de interés y comprende una secuencia de polinucleótidos L-2 que es complementaria de unasecuencia de polinucleótidos del componente del sistema de sonda marcadora, y en donde los por lo menosdos extensores marcadores tienen todos L1-5' de L-2 o tienen todos L-1 3' de L-2;

c) hibridarse el ácido nucleico de interés con los m extensores marcadores, y

d) hibridarse el sistema de sonda marcadora con los m extensores marcadores a una temperatura dehibridación, que es mayor que la temperatura de fusión Tm de un complejo entre cada extensor marcadorindividual y el componente del sistema de sonda marcadora, en donde el ácido nucleico de interés se se hibridacon los m extensores marcadores, y el sistema de sonda marcadora se se hibrida con los m extensoresmarcadores a la citada temperatura de hibridación, capturando de este modo al marcador asociado al ácidonucleico de interés.

Detección múltiplex de ácidos nucleicos Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud es una solicitud de patente de utilidad no provisional que reivindica la prioridad y se beneficia de la siguiente solicitud de patente provisional prioritaria: USSN 60/691.834, presentada el 20 de junio de 2005, titulada “Método de detección y recuento de células raras de poblaciones de células grandes heterogéneas” de Luo y Chen.

Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la detección de ácidos nucleicos. La invención incluye métodos para la detección de ácidos nucleicos, incluidos los métodos de detección de la presencia de dos o más ácidos nucleicos de forma simultánea en una sola muestra. La solicitud también incluye composiciones y kits relacionados con estos métodos.

Antecedentes de la invención El perfil de expresión génica global y otras tecnologías han identificado un gran número de genes cuya expresión está alterada, p. ej., en los tejidos enfermos o en los tejidos y las células tratadas con agentes farmacéuticos (Lockhart y Winzeler (2000) “Genomics, gene expression and ADN arrays” Nature 405:827-36 y Gunther et al. (2003) “Prediction of clinical drug efficacy by classification of drug-induced genomic expression profiles in vitro” Proc Natl Acad Sci USA 100:9608-13. Estos genes se están utilizando cada vez más como biomarcadores en el diagnóstico de enfermedades, estadificación y pronóstico (Golub et al. (1999) “Molecular classification of cancer: class discover y and class prediction by gene expression monitoring” Science 286:531-7) , identificación de dianas, validación y análisis de rutas (Roberts et al. (2000) “Signaling and circuitr y of multiple MAPK pathways revealed by a matrix of global gene expression profiles” Science 287:873-80) ; rastreo de fármacos (Hamadeh et al. (2002) “Prediction of compound signature using high density gene expression profiling” Toxicol Sci 67:232-40 ) ; y estudios de eficacia de fármacos, relación estructura-actividad, toxicidad y interacciones fármaco - diana (Gerhold et al. (2001) “Monitoring expression of genes involved in drug metabolism and toxicology using ADN microarrays” Physiol Genomics 5:161-70 y Thomas et al. (2001) “Identification of toxicologically predictive gene sets using cADN microarrays” Mol Pharmacol 60:1189-94 ) . A medida que se identifican biomarcadores, su implicación en el tratamiento de enfermedades y en el desarrollo de fármacos tendrá que ser evaluado para un mayor rendimiento y mayores poblaciones de las muestras. Por lo tanto, se necesitan tecnologías de análisis de la expresión génica más flexibles y sencillas que permitan el análisis de la expresión de múltiples genes con una mayor calidad de los datos y un mayor rendimiento.

Los niveles de expresión de ARN tradicionalmente se han medido utilizando Northern blot y ensayos de protección de nucleasa. Sin embargo, estos métodos levan mucho tiempo y tienen una sensibilidad limitada, y los datos generados son más cualitativos que cuantitativos en la naturaleza. Una mayor sensibilidad y cuantificación son posibles con los métodos basados en la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) , tal como la RT-PCR cuantitativa en tiempo real, pero estos enfoques tienen bajas capacidades múltiplex (Bustin (2002) “Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR) : trends and problems” J Mol Endocrinol 29:23-39 y Bustin and Nolan (2004) “Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction” J Biomol Tech. 15:155-66 ) . La tecnología de micromatrices se ha utilizado extensamente en investigación, pero su sensibilidad moderada y el procedimiento experimental relativamente largo han limitado su uso en las aplicaciones de perfiles de expresión de alto rendimiento (Epstein and Butow (2000) “Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge” Curr Opin Biotechnol. 11:36-41) .

La mayoría de los métodos actuales de cuantificación del ARNm requieren el aislamiento de ARN, transcripción inversa y amplificación de la diana, introduciendo cada uno de ellos una variabilidad que conduce a una precisión global del ensayo baja. Recientemente, se ha informado de un ensayo de selección múltiple para la cuantificación del ARNm que combina la protección de nucleasa con la detección por red luminiscente (Martel et al. (2002) “Multiplexed screening assay for mRNA combining nuclease protection with luminescent array detection” Assay Drug Dev Technol. 1:61-71) . Aunque este ensayo tiene la ventaja de la medición de transcritos de ARNm directamente a partir de lisados de células, se informa de que la sensibilidad del ensayo y la reproducibilidad son limitadas. También se informó de otro ensayo múltiplex de ARNm sin la necesidad del aislamiento de ARN (Tian et al. (2004) “Multiplex mRNA assay using electrophoretic tags for high-throughput gene expression analysis” Nucleic Acids Res. 32:e126) . Este ensayo asocia el ensayo de Invader® ARNm primario con pequeñas moléculas fluorescentes eTags que se pueden distinguir por electroforesis capilar por las diferentes relaciones de carga -masa de las eTags. Sin embargo, este ensayo requiere el uso de un grupo de sondas de señal eTagged especialmente diseñado y sintetizado, un equipo de electroforesis capilar complicado, y un paquete especial de análisis de datos.

Otra tecnología para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos diana es la tecnología de amplificación de la señal de ADN ramificado tal y como se describe en p. ej. Hartley et al. (Drug Metabolism and Disposition, 2000, vol. 28, No. 5, p. 608-616) .

Entre otros aspectos, la presente invención proporciona métodos que superen las limitaciones indicadas anteriormente y permitan la detección rápida, sencilla, sensible y de múltiples ARNm (y/o otros ácidos nucleicos) de forma simultánea. Una comprensión completa de la invención se obtendrá después del análisis de lo siguiente.

Compendio de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para la detección de los ácidos nucleicos de interés. Los ácidos nucleicos son capturados en un soporte sólido y luego detectados. También se describen aquí las composiciones, kits y sistemas relacionados con estos métodos.

Una primera clase general de realizaciones incluye los métodos de detección de dos o más ácidos nucleicos de interés. En estos métodos se proporcionan, una muestra que comprende o se sospecha que comprende los ácidos nucleicos de interés, dos o más subgrupos de m extensores marcadores, en la que m es por lo menos dos, y un sistema de marcaje de sondas. Cada subgrupo de m extensores marcadores es capaz de hibridarse con uno de los ácidos nucleicos de interés. El sistema de marcaje de sondas comprende un marcador, y un componente del sistema de marcaje de sondas capaz de hibridarse simultáneamente con por lo menos dos de los m extensores marcadores de un subgrupo.

Los ácidos nucleicos de interés presentes en la muestra son capturados en un soporte sólido. Cada ácido nucleico de interés capturado en el soporte sólido se hibrida con su correspondiente subgrupo de m extensores marcadores, y el sistema de marcaje de sonda se hibrida con los m extensores marcadores. A continuación, se detecta la presencia o ausencia del marcador sobre el soporte sólido. Dado que el marcador está asociado con el ácido nucleico de interés a través de la hibridación de los extensores marcadores y del sistema de marcaje de la sonda, se establece una correlación entre la presencia o ausencia del marcador sobre el soporte sólido y la presencia o ausencia del ácido nucleico de interés en el soporte sólido y por lo tanto en la muestra original.

En una clase de realizaciones, se proporciona una población combinada de las partículas que constituyen el soporte sólido. La población se compone de dos o más subgrupos de partículas, y una pluralidad de partículas de cada subgrupo se distingue de una pluralidad de partículas de cada uno de los otros subgrupos. Las partículas en cada subgrupo se han asociado con un tipo sonda de captura diferente. También se proporcionan dos o más subgrupos de n extensores de captura, en donde n es por lo menos dos. Cada subgrupo de n extensores de captura es capaz de hibridarse con uno de los ácidos nucleicos de interés, y los extensores de captura de cada subgrupo son capaces de hibridarse con una de las sondas de captura, asociando de esta manera cada subgrupo de n extensores de captura con un subgrupo seleccionado de las partículas. Cada uno de los... [Seguir leyendo]

1. Un método de captura de un marcador de un ácido nucleico de interés, método que comprende:

a) proporcionar m extensores marcadores, en donde m es por lo menos dos, en donde los m extensores marcadores son capaces de hibridarse con el ácido nucleico de interés;

b) proporcionar un sistema de sistema de sonda marcadora que comprende el marcador, en donde un componente del sistema de sonda marcadora es capaz de hibridarse simultáneamente con por lo menos dos de los m extensores marcadores, donde cada uno de los por lo menos dos extensores marcadores comprende una secuencia de polinucleótidos L-1 que es complementaria de una secuencia de polinucleótidos del ácido nucleico de interés y comprende una secuencia de polinucleótidos L-2 que es complementaria de una secuencia de polinucleótidos del componente del sistema de sonda marcadora, y en donde los por lo menos dos extensores marcadores tienen todos L1-5' de L-2 o tienen todos L-1 3' de L-2;

c) hibridarse el ácido nucleico de interés con los m extensores marcadores, y

d) hibridarse el sistema de sonda marcadora con los m extensores marcadores a una temperatura de hibridación, que es mayor que la temperatura de fusión Tm de un complejo entre cada extensor marcador individual y el componente del sistema de sonda marcadora, en donde el ácido nucleico de interés se se hibrida con los m extensores marcadores, y el sistema de sonda marcadora se se hibrida con los m extensores marcadores a la citada temperatura de hibridación, capturando de este modo al marcador asociado al ácido nucleico de interés.

2. El método de la reivindicación 1, en donde todos los m extensores marcadores tienen L-1 5' de L-2 o todos tienen L-1 3' de L-2.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el sistema de sonda marcadora comprende un multímero de amplificación o preamplificador, donde el citado multímero de amplificación o preamplificador es capaz de hibridarse con por lo menos dos de los m extensores marcadores.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el sistema de sonda marcadora comprende un preamplificador, un multímero de amplificación y una sonda marcadora; en donde el preamplificador es capaz de hibridarse simultáneamente con por lo menos dos de los m extensores marcadores y con una pluralidad de multímeros de amplificación; en donde el multímero de amplificación es capaz de hibridarse simultáneamente con el preamplificador y con una pluralidad de sondas marcadoras; y donde la sonda marcadora comprende el marcador.

5. El método según la reivindicación 1, en donde el sistema de sonda marcadora comprende un multímero de amplificación y una sonda marcadora; donde el multímero de amplificación es capaz de hibridarse simultáneamente con por lo menos dos de los m extensores marcadores y con una pluralidad de sondas marcadoras; y donde la sonda marcadora comprende el marcador.

6. El método según la reivindicación 1, en donde el sistema de sonda marcadora comprende una sonda marcadora; donde la sonda marcadora es capaz de hibridarse simultáneamente con por lo menos dos de los m extensores marcadores; y donde la sonda marcadora comprende el marcador.

7. El método según la reivindicación 1, en donde el componente del sistema de sonda marcadora es capaz de hibridarse simultáneamente con por lo menos dos de los m extensores marcadores.

8. El método según la reivindicación 1, en donde la temperatura de hibridación está aproximadamente 5ºC por encima o más que la temperatura Tm de un complejo entre cada extensor marcador individual y el componente del sistema de la sonda marcadora.

9. El método según la reivindicación 1, en donde la temperatura de hibridación está aproximadamente 7º C por encima o más, aproximadamente 10º C por encima o más, aproximadamente 12º C por encima o más, aproximadamente 15º C por encima o más, aproximadamente 17º C por encima o más, aproximadamente 20º C por encima o más que la Tm de un complejo entre cada extensor marcador individual y el componente del sistema de la sonda marcadora.

10. El método según la reivindicación 1, en donde la secuencia de polinucleótidos L-2 tiene una longitud de 20 nucleótidos o inferior.

11. El método según la reivindicación 10, en donde L-2 tiene una longitud comprendida entre 9 y 17 nucleótidos, o

entre 13 y 15 nucleótidos.

12. El método según la reivindicación 1, en donde cada uno de los por lo menos dos m extensores marcadores mencionados tienen L-1 en el extremo 5' y L-2 en el extremo 3'.

13. El método según la reivindicación 1, en donde cada uno de los por lo menos dos m extensores marcadores mencionados tienen L-1 en el extremo 3' y L-2 en el extremo 5'.

14. El método según la reivindicación 1, que comprende capturar el acido nucleico de interés sobre un soporte sólido.

15. El método según la reivindicación 1, que comprende detector una señal procedente de la sonda.