Composiciones para la amplificación isotérmica lineal de secuencias de polinucleótidos.

Un kit para amplificar una secuencia de polinucleótidos, que comprende un cebador compuesto en donde elcebador compuesto comprende una porción de ARN y una porción de ADN 3',

y en donde la porción de ARN estotalmente complementaria a la secuencia de polinucleótidos y tiene al menos aproximadamente cualquiera entre 1,3, 4 o 5 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera entre 10, 15, 20, 25 o 30 nucleótidos y laporción de ADN 3' es complementaria al menos en un 95% a la secuencia de polinucleótidos y tiene al menos aproximadamentecualquiera entre 1, 3, 5, 7 o 10 nucleótidos con un límite superior de aproximadamente 10, 12, 15 o 18nucleótidos

Composiciones para la amplificación isotérmica lineal de secuencias de polinucleótidos

Campo técnico

La invención se refiere al campo de la amplificación de polinucleótidos. Más particularmente, la invención proporcio5 na composiciones y kits para amplificar (es decir, realizar múltiples copias) secuencias de polinucleótidos diana que emplean un único cebador compuesto de ARN/ADN, implicando opcionalmente la amplificación una transcripción.

Antecedentes En los últimos años, el desarrollo de métodos para amplificar ácidos nucleicos y detectar los productos de la amplificación han fomentado la detección, la identificación, la cuantificación y los análisis de la secuencia de secuencias de ácidos nucleicos.

El análisis de ácidos nucleicos es útil para detectar e identificar agentes patógenos, detectar una alteración génica que conduce a fenotipos definidos, diagnosticar enfermedades genéticas o la susceptibilidad de una enfermedad, determinar la expresión génica en desarrollo, una enfermedad y como respuesta a estímulos definidos, así como para los diferentes proyectos sobre el genoma. Otras aplicaciones del método de amplificación de ácidos nucleicos, 15 son la detección de células poco comunes, la detección de agentes patógenos y la detección de una expresión génica alterada en el cáncer, y similares. La amplificación de ácidos nucleicos es potencialmente útil para el análisis cualitativo, tal como la detección de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos definidas y para la cuantificación de secuencias génicas definidas. Esta última es útil para determinar y cuantificar secuencias patógenas, así como para determinar la multiplicación o la deleción génica, que se encuentra frecuentemente en la transformación celular

de un tipo de célula normal a maligna.

La detección de alteraciones de la secuencia en una secuencia de ácido nucleico, es importante para la detección de genotipos mutantes, que es apropiada para el análisis genético, para la detección de mutaciones que conducen a la resistencia a fármacos, para la farmacogenómica, etc. Diversos métodos para detectar mutaciones específicas incluyen la extensión de un cebador específico de alelo, la ligación de una sonda específica de alelo y la hibridación 25 de una sonda diferencial. Véanse, por ejemplo, los documentos de patentes de EE.UU. nº 5.888.819; 6.004.744; 5.882.867; 5.710.028; 6.027.889; 6.004.745; y WO US88/02746. Los métodos para detectar la presencia de alteraciones de la secuencia en una secuencia definida de ácidos nucleicos, sin un conocimiento específico de la alteración, también están descritos. Algunos de estos métodos se basan en la detección de emparejamientos incorrectos formados por la hibridación de un producto de amplificación del ensayo con un producto de amplificación de referen30 cia. La presencia de emparejamientos incorrectos en tales heterohíbridos se puede detectar empleando proteínas que se unen de forma específica al emparejamiento incorrecto o mediante escisión química o enzimática del emparejamiento incorrecto. Un método para detectar una alteración de la secuencia que se basa en la inhibición de la migración ramificada en estructuras cruciformes de ADN de cuatro hebras, ha sido descrito recientemente. Véase, por ejemplo Lishanski, A. y col. Nucleic Acids Res 28 (9) ; E42 (2000) . Otros métodos se basan en la detección de 35 configuraciones específicas de productos de la amplificación monocatenarios. La estructura secundaria de un ADN o ARN monocatenario depende de la secuencia específica. Alteraciones de la secuencia en una diana de ácido nucleico para ensayo, en relación con una secuencia de referencia, conducen a una configuración alterada. La configuración alterada de un producto de la amplificación monocatenario se puede detectar por un cambio en la movilidad electroforética del producto de la amplificación del ensayo, comparada con la de un producto de amplificación de 40 referencia. El polimorfismo en la configuración monocatenaria, SSCP, se emplea habitualmente para detectar alteraciones de la secuencia. Véase, por ejemplo, Orita M. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (8) :2766-70 (1989) ; Suzuki,

Y. y col. Oncogene 5 (7) :1037-43 (1990) ; y el documento de patente de EE.UU. nº 5.871.697. Este método también se emplea en la identificación microbiana que se basa en los cambios definidos en una secuencia específica de ácido nucleico, en especies o cepas diferentes. La detección de mutaciones que emplea los métodos de SSCP,

emplea principalmente productos de la amplificación de ADN, sin embargo, también se han descrito métodos de SSCP con ARN. La configuración dependiente de la secuencia de un ARN monocatenario está bien documentada y se mostró que conduce a un patrón definido de movilidad electroforética. Véase, por ejemplo, Sarkar y col. Nucleic Acid Research 20 (4) :871-878 (1992) y Gasparini y col. Hum. Genet. 97:492-495 (1996) .

Aunque la detección de la presencia de una secuencia definida de ácido nucleico y el análisis de su secuencia, se 50 pueden realizar mediante hibridación con sonda, el método carece generalmente de sensibilidad cuando en la muestra del ensayo están presentes pequeñas cantidades de la secuencia del ácido nucleico, tal y como unas pocas moléculas. Una solución para este obstáculo fue el desarrollo de métodos para generar copias múltiples de la secuencia de ácido nucleico definida, que eran adecuadas para un análisis posterior. Los métodos para generar copias múltiples de una secuencia específica de ácido nucleico se definen generalmente como métodos de amplificación de 55 la diana. Otros métodos para incrementar la sensibilidad de la detección del análisis de hibridación se basan en la generación de productos múltiples a partir de la sonda hibridada, o las sondas, por ejemplo, escisión de la sonda hibridada para formar múltiples productos o la ligación de sondas adyacentes para formar un solo producto dependiente de hibridación. De forma similar, una sensibilidad incrementada de la reacción de hibridación se consiguió por métodos de amplificación de señales generadas por el suceso de hibridación, tal como el método basado en la hibri

dación de sondas de ADN ramificado.

Existen muchas variaciones de la amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, amplificación exponencial, amplificación lineal ligada, amplificación basada en la ligación y amplificación basada en la transcripción. Un ejemplo de método de amplificación exponencial de ácidos nucleicos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se ha descrito en numerosas publicaciones. Véase, por ejemplo, Mullis y col. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986) ; Mullis K., documento EP 201.184; Mullis y col., documento de patente de EE.UU. nº 4.582.788; Erlich y col., documentos EP 50.424, EP 84.796, EP 258.017, EP 237.362; y Saiki R. y col., documento de patente de EE.UU. nº 4.683.194. La amplificación lineal ligada está descrita por Wallace y col. en el documento de patente de EE.UU. nº 6.027.923. Ejemplos de amplificación basada en la ligación son la reacción de amplificación y ligación (LAR) , descrita por Wu y col. en Genomics 4:560 (1989) y la reacción en cadena de la ligasa, descrita en el documento de solicitud EP nº 0320308B1. En los documentos de patentes de EE.UU. nº 5.766.849 y 5.654.142, se describen diversos métodos de amplificación basada en la transcripción; y también Kwoh y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:1173 (1989) y Ginergeras y col. en el documento WO 88/10315.

El método de amplificación de una diana, empleado más generalmente es la reacción en cadena de la polimerasa, PCR, que se basa en múltiples ciclos de desnaturalización, hibridación de dos cebadores de oligonucleótidos, cada uno para una cadena opuesta de las cadenas dianas, y la extensión del cebador mediante una polimerasa de nucleótidos para producir copias múltiples bicatenarias de la secuencia diana. Se han descrito muchas variaciones de la PCR y el método se está utilizando para amplificar secuencias de ácido nucleico de ADN o de ARN, para secuenciación, para análisis de mutaciones y otros. Los métodos basados en la termociclación que emplean un cebador aislado, también se han descrito. Véanse, por ejemplo, los documentos de patentes de EE.UU. nº 5.508.178; 5.595.891; 5.683.879; 5.130.238 y 5.679.512. El cebador puede ser un cebador quimérico de ADN/ARN, tal y como se describe en el documento de patente de EE.UU. nº 5.744.308. Otros métodos que dependen de la ciclación térmica son la reacción en cadena de la ligasa (LCR) y la reacción en cadena relacionada con la reparación (RCR, del inglés “related repair chain... [Seguir leyendo]

1. Un kit para amplificar una secuencia de polinucleótidos, que comprende un cebador compuesto en donde el cebador compuesto comprende una porción de ARN y una porción de ADN 3’, y en donde la porción de ARN es totalmente complementaria a la secuencia de polinucleótidos y tiene al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 4 o 5 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera entre 10, 15, 20, 25 o 30 nucleótidos y la porción de ADN 3’ es complementaria al menos en un 95% a la secuencia de polinucleótidos y tiene al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7 o 10 nucleótidos con un límite superior de aproximadamente 10, 12, 15 o 18 nucleótidos.

2. El kit según la reivindicación 1, en donde la porción de ARN consiste en cualquiera de 3 a 30 nucleótidos, 5 a 30 nucleótidos, 3 a 25 nucleótidos, 5 a 25 nucleótidos, 3 a 20 nucleótidos, 5 a 20 nucleótidos, 3 a 18 nucleótidos, 3 a 15 nucleótidos, 5 a 18 nucleótidos, 5 a 15 nucleótidos, 3 a 12 nucleótidos o 5 a 12 nucleótidos.

3. El kit según la reivindicación 1 o 2, en donde la porción de ADN 3’ consiste en cualquiera entre 3 a 18 nucleótidos, 3 a 15 nucleótidos, 3 a 12 nucleótidos, 5 a 18 nucleótidos, 5 a 15 nucleótidos, 5 a 12 nucleótidos, 7 a 18 nucleótidos, 7 a 15 nucleótidos, 7 a 12 nucleótidos, 10 a 18 nucleótidos, 10 a 15 nucleótidos o 10 a 12 nucleótidos.

4. El kit según la reivindicación 1, en donde el cebador compuesto comprende una porción de ARN 5’ y una porción de ADN 3’, y en donde la porción de ARN 5’ tiene al menos aproximadamente cualquiera entre 3, 5, 7, 8 o 10 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera entre 15, 17, 18 o 20 nucleótidos y la porción de ADN 3’ tiene al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7 o 10 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera entre 10, 12, 15 o 18 nucleótidos.

5. El kit según la reivindicación 4, en donde dicha porción de ARN 5’ es adyacente a dicha porción de ADN 3’.

6. El kit según la reivindicación 4 o 5, en donde la porción de ARN consiste en cualquiera de 3 a 20 nucleótidos, 3 a 18 nucleótidos, 3 a 15 nucleótidos, 5 a 20 nucleótidos, 5 a 18 nucleótidos, 5 a 15 nucleótidos, 10 a 20 nucleótidos, 10 a 18 nucleótidos, 10 a 15 nucleótidos, 7 a 20 nucleótidos, 7 a 18 nucleótidos o 7 a 15 nucleótidos.

7. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la porción de ADN consiste en cualquiera de 3 a 18 nucleótidos, 3 a 15 nucleótidos, 3 a 12 nucleótidos, 3 a 10 nucleótidos, 5 a 18 nucleótidos, 5 a 15 nucleótidos, 5 a 12 nucleótidos, 5 a 10 nucleótidos, 7 a 18 nucleótidos, 7 a 15 nucleótidos, 7 a 12 nucleótidos, 7 a 10 nucleótidos, 10 a 18 nucleótidos, 10 a 15 nucleótidos o 10 a 12 nucleótidos.

8. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cebador compuesto consiste en la porción de ARN y la porción de ADN.

9. El kit según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente una enzima que escinde el ARN a partir de un híbrido de ARN/ADN.

10. El kit según la reivindicación 9, en donde la enzima que escinde el ARN a partir del híbrido de ARN/ADN es ARNasaH.

11. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente una polimerasa de ADN.

12. Una composición que comprende un cebador compuesto según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. La composición según la reivindicación 12, que comprende adicionalmente una enzima que escinde el ARN a partir de un híbrido de ARN/ADN.

14. La composición según la reivindicación 13, en donde la enzima que escinde el ARN a partir de un híbrido de ARN/ADN es ARNasaH.

15. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende adicionalmente una polimerasa de ADN.

16. El kit según la reivindicación 1, en donde la porción de ARN es totalmente complementaria a la secuencia de tipo silvestre o a una variante de secuencia de la secuencia de polinucleótidos.

17. El kit según la reivindicación 1, en donde la variante de secuencia de la secuencia de polinucleótidos comprende un solo polimorfismo de nucleótidos.

18. Un kit para amplificar una secuencia de polinucleótidos que comprende un cebador compuesto, en donde el cebador compuesto comprende una porción de ARN y una porción de ADN 3’, y en donde la porción de ARN comprende una secuencia complementaria a una variante de secuencia de la secuencia de polinucleótidos y tiene al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 4 o 5 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cual

quiera entre 10, 15, 20, 25 o 30 nucleótidos y la porción de ADN 3’ tiene al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7 o 10 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera entre 10, 12, 15 o 18 nucleótidos; y una enzima que escinde el ARN a partir de un híbrido de ARN/ADN.

19. El kit según la reivindicación 16, en donde la variante de secuencia de la secuencia de polinucleótidos comprende un solo polimorfismo de nucleótidos.