Complejos de ligandos de ácidos nucleicos de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).

Un complejo constituido por un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico y un ligando deácido nucleico que se une específicamente a PDGF,

en el que el ligando de ácido nucleico es monocatenario ycomprende la secuencia:**Fórmula**

en la que A, C, G, T ≥ desoxi-A, C, G, T; A,G ≥ 2'OMe-A,G; y C,U ≥ 2'-F-C,U.

Complejos de ligandos de ácidos nucleicos de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En este documento se describen ligandos de ADNss y ARN de alta afinidad para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . El procedimiento utilizado en este documento para identificar dichos ligandos de ácidos nucleicos se denomina SELEX, un acrónico de Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento 10 Exponencial (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) . En esta invención se incluye adicionalmente un procedimiento para preparar un complejo terapéutico o diagnóstico constituido por un ligando de ácido nucleico de PDGF y un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico o un compuesto lipófilo identificando un ligando de ácido nucleico de PDGF mediante la metodología SELEX y uniendo covalentemente el ligando de ácido nucleico de PDGF con un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico o un compuesto 15 lipófilo. La invención incluye adicionalmente complejos constituidos por uno o más ligandos de ácido nucleico de PDGF y un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico o un compuesto lipófilo. La invención se refiere adicionalmente a mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ligando de ácido nucleico de PDGF uniendo covalentemente el ligando de ácido nucleico de PDGF con un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico o un compuesto lipófilo para formar un complejo. La invención se refiere adicionalmente a mejorar las propiedades 20 farmacocinéticas de un ligando de ácido nucleico de PDGF usando una construcción lipídica que comprende un ligando de ácido nucleico de PDGF o un complejo que comprende un ligando de ácido nucleico de PDGF y un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico o un compuesto lipófilo. Esta invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para dirigir un agente terapéutico o de diagnóstico a una diana biológica que expresa PDGF asociando el agente con un complejo constituido por un ligando de ácido nucleico de PDGF y un compuesto lipófilo o un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico, en el que el complejo está asociado adicionalmente con una construcción lipídica y el ligando de ácido nucleico de PDGF está asociado adicionalmente con el exterior de la construcción lipídica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

A. El Procedimiento SELEX

El dogma durante muchos años fue que los ácidos nucleicos tenían principalmente una función informativa. A través de un procedimiento conocido como Evolución Sistemática de Ligandos por enriquecimiento Exponencial, 35 denominado SELEX, se hizo evidente que los ácidos nucleicos tenían una diversidad estructural tridimensional similar a las proteínas. SELEX es un procedimiento para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con unión altamente específica a moléculas diana y se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/536, 428, presentada el 11 de junio de 1990, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment", ahora abandonada, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/714.131, presentada el 10 40 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos Nº 5.475.096, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/931.473, presentada el 17 de agosto de 1992, titulada "Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos Nº 5.270.163 (véase también el documento WO 91/19813) . Cada una de estas aplicaciones, denominadas en conjunto en este documento como las Solicitudes de Patente SELEX, describe un procedimiento fundamentalmente novedoso para preparar un ligando de ácido 45 nucleico para cualquier molécula diana deseada. El proceso SELEX proporciona una clase de productos que se denominan ligandos de ácido nucleico, teniendo cada ligando una única secuencia, y que tiene la propiedad de unirse específicamente a un compuesto o molécula diana deseada. Cada ligando de ácido nucleico identificado por SELEX es un ligando específico de un compuesto o molécula diana determinada. SELEX es basa en la visión única de que los ácidos nucleicos tienen suficiente capacidad para formar una diversidad de estructuras bidimensionales o 50 tridimensionales y una versatilidad química suficiente disponible en sus monómeros para actuar como ligandos (forman pares de unión específicos) virtualmente con cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como dianas.

El procedimiento SELEX implica la selección de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones 55 paso a paso de unión, reparto y amplificación, usando el mismo esquema de selección general, para lograr virtualmente cualquier criterio deseado de selectividad y afinidad de unión. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprende preferiblemente un segmento de secuencia aleatoria, el procedimiento SELEX incluye las etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de los ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las moléculas diana, disociar los complejos ácido nucleico-diana, amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleico-diana para obtener una mezcla enriquecida de ligandos de ácidos nucleicos, a continuación reiterar las etapas de unión, separación, disociación y amplificación durante tantos ciclos como se desee para obtener ligandos de ácidos nucleicos de alta afinidad altamente específicos para la molécula diana.

Se ha reconocido por los presentes inventores que el procedimiento SELEX demuestra que los ácidos nucleicos en forma de compuestos químicos pueden formar un amplio conjunto de formas, tamaños y configuraciones, y son capaces de un repertorio mucho más amplio de unión y otras funciones que las mostradas por los ácidos nucleicos en sistemas biológicos.

Los presentes inventores han reconocido que los procesos SELEX o similares a SELEX pueden usarse para identificar ácidos nucleicos que puedan facilitar cualquier reacción seleccionada de una manera similar a la que puede identificarse en los ligandos de ácido nucleico para cualquier diana determinada. En teoría, en una mezcla de candidatos de aproximadamente 1013 a 1018 ácidos nucleicos, los presentes inventores postulan que existe al menos un ácido nucleico con la forma apropiada para facilitar cada una de una amplia diversidad de interacciones físicas y químicas.

El procedimiento SELEX básico se ha modificado para conseguir varios objetivos específicos. Por ejemplo, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/960.093, presentada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure", describe el uso de SELEX junto con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tal como ADN plegado. Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/123.935, presentada el 17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands", describe un procedimiento basado en SELEX para seleccionar ligandos de ácido nucleico que contienen grupos fotorreactivos capaces de unir y/o fotorreticular a y/o fotoinactivar

una molécula diana. Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/134.028, presentada el 7 de octubre de 1993, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", abandonada a favor de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/443.957, ahora la Patente de Estados Unidos Nº 5.580.737, describe un procedimiento para identificar ligandos de ácido nucleico altamente específicos capaces de discriminar entre moléculas muy relacionadas, que pueden ser no peptídicas, llamado Counter-SELEX. Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/143.564, presentada el 25 de octubre de 1993, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", abandonada a favor de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº de Serie 08/461.069, ahora la Patente de Estados Unidos Nº 5.567.588, describe un procedimiento basado en SELEX que consigue una separación altamente eficaz entre los oligonucleótidos que tienen una afinidad alta y una afinidad baja para una molécula diana.

El procedimiento SELEX comprende la identificación de ligandos de ácido nucleico de elevada afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas sobre el ligando, tales como estabilidad in vivo mejorada, o características mejoradas de distribución. Ejemplos de estas modificaciones incluyen... [Seguir leyendo]

1. Un complejo constituido por un compuesto de alto peso molecular no inmunogénico y un ligando de ácido nucleico que se une específicamente a PDGF, en el que el ligando de ácido nucleico es monocatenario y 5 comprende la secuencia:

en la que A, C, G, T = desoxi-A, C, G, T; A, G = 2'OMe-A, G; y C, U .

2. F-C, U.

2. El complejo de la reivindicación 1, en el que el ligando de ácido nucleico comprende la secuencia:

en la que PEG es pentaetilenglicol.

3. El complejo de la reivindicación 1, en el que el ligando de ácido nucleico comprende la secuencia:

en la que PEG es hexaetilenglicol.

4. El complejo de la reivindicación 2, en el que PEG es:

5. El complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de ligando de 10 ácido nucleico comprende adicionalmente una T en orientación inversa en la dirección 3'.

6. El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende adicionalmente un enlazador entre el ligando de ácido nucleico y el compuesto de alto peso molecular no inmunogénico.

7. El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto de alto peso molecular no inmunogénico está unido al ligando de ácido nucleico a través de un enlazador.

8. El complejo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el compuesto de alto peso molecular

no inmunogénico comprende uno o más polialquilenglicoles. 20

9. El complejo de la reivindicación 8, en el que cada uno de los polialquilenglicoles es polietilenglicol.

10. El complejo de la reivindicación 9, en el que el compuesto de alto peso molecular no inmunogénico

comprende más de un polietilenglicol y la suma del peso molecular de los polietilenglicoles está entre 10-80 K. 25

11. El complejo de la reivindicación 9, en el que el compuesto de alto peso molecular no inmunogénico comprende más de un polietilenglicol y la suma del peso molecular de los polietilenglicoles está entr.

2. 45 K.

12. Un procedimiento para la preparación de un complejo de acuerdo con una cualquiera de las

reivindicaciones anteriores, comprendiendo el procedimiento: asociar el ligando de ácido nucleico con el compuesto de alto peso molecular no inmunogénico.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la etapa de asociación comprende unir de forma covalente, a través de un enlazador, el ligando de ácido nucleico con el compuesto de alto peso molecular no 35 inmunogénico.

14. Una composición terapéutica que comprende el complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

15. Un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en un procedimiento de inhibición de una enfermedad mediada por PDGF, en el que la enfermedad mediada por PDGF se selecciona entre cáncer, reestenosis, fibrosis, enfermedad renal o enfermedad cardiovascular.

16. Un complejo para su uso en un procedimiento de inhibición de la enfermedad mediada por PDGF de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el complejo es para su uso en la inhibición del crecimiento de tumores.

17. Un complejo para su uso en la inhibición del crecimiento de tumores de acuerdo con la reivindicación 16, en el que los tumores o células o tejidos que rodean los tumores expresan PDGF o receptores de PDGF.

18. Un complejo para su uso en un procedimiento de inhibición de una enfermedad mediada por PDGF de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el complejo es para su uso en la inhibición de fibrosis.

19. Un complejo para su uso en un procedimiento de inhibición de una enfermedad mediada por PDGF de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la fibrosis se selecciona entre el grupo que consiste en fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis de la médula ósea y fibrosis asociada a un tratamiento de radiación.

20. Un complejo para su uso en un procedimiento de inhibición de una enfermedad mediada por PDGF de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el complejo es para su uso en la inhibición de la reestenosis.

21. Un complejo para su uso en la inhibición de reestenosis de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la reestenosis se selecciona entre el grupo que consiste en reestenosis intrastent, reestenosis de la arteria coronaria y reestenosis de los vasos no coronarios.

22. Uso de un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de una composición terapéutica para su uso en la inhibición de una enfermedad mediada por PDGF, en el que la enfermedad mediada por PDGF es cáncer, reestenosis, fibrosis, enfermedad renal o enfermedad cardiovascular.

23. Un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que comprende adicionalmente un agente terapéutico o diagnóstico para su uso en el direccionamiento del agente terapéutico o de diagnóstico a una diana biológica específica predeterminada que expresa PDGF.

24. Uso de un complejo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende adicionalmente un agente terapéutico o de diagnóstico en la fabricación de una composición terapéutica para dirigir el agente terapéutico o de diagnóstico a una diana biológica específica predeterminada que expresa PDGF.