Biomarcadores de la enfermedad de Chagas.

Biomarcadores de la enfermedad de Chagas.

La presente invención pertenece al campo de la inmunología,

parasitología y de las enfermedades infecciosas, en particular se refiere a la enfermedad de Chagas causada por el parásito Trypanosoma cruzi. La presente invención se refiere a un péptido reconocido por células mononucleares de pacientes de la enfermedad de Chagas y a una molécula quimérica que lo comprende. Se refiere también a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido y/o molécula quimérica y a su uso para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Asimismo, se refiere al uso de dicho péptido o dicha molécula quimérica como biomarcador de la infección por T, cruzi, de la fase de la patología de la enfermedad de Chagas y del impacto terapéutico del tratamiento de dicha enfermedad.

Biomarcadores de la enfermedad de Chagas

Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la inmunología, parasitología y enfermedades infecciosas, en particular se refiere a un péptido reconocido por células mononucleares de pacientes de la enfermedad de Chagas y a una molécula quimérica que lo comprende. Asimismo, se refiere al uso de dicho péptido o molécula quimérica como biomarcadores de la enfermedad de Chagas y en inmunoterapia frente a dicha enfermedad.

Antecedentes de la invención Tr y panosoma cruzi (T cruz/) es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Este parásito protozoario afecta a casi 10 millones de personas en América Latina, y aproximadamente 75-90 millones de personas están en riesgo de infección. Existen diferentes fases de la patología de la enfermedad de Chagas. La fase aguda se produce poco después de la infección, tiene una duración de dos a tres meses aproximadamente y en la mayoría de los casos presenta síntomas inespecíficos que dificultan su diagnóstico. En ausencia de tratamiento, la fase aguda es seguida por una fase crónica indeterminada en la que los parásitos persisten en los tejidos, donde el paciente está infectado pero no tiene sintomatología. Para el 30-40% de pacientes esta fase deriva en una fase crónica sintomática caracterizada principalmente por la existencia de alteraciones cardiacas y/o digestivas (referida en adelante como CCC/DIG) , a la cual se asocia con una alta morbilidad. En esta fase crónica sintomática se observa la aparición de cardiomegalia, anormalidades electrocardiográficas, arritmias, aperistalsis, megaesófago y megacolon, pudiendo llegar a causar la muerte. Esta fase tiene distintos grados de severidad/gravedad (1, 11, 111) dependiendo de las alteraciones del órgano en cuestión, motivadas por el daño tisular que ocasiona el parásito (Kuschnir et al., 1985. Arq Bras Cardiol 45, 249-56) .

Actualmente no existe ninguna vacuna que confiera protección contra Tr y panosoma cruzi, sí se dispone, no obstante, de fármacos para tratar esta enfermedad, como Nifurtimox, desarrollado en 1960 por Bayer, y Benznidazol, desarrollado en 1974 por Roche. Estos fármacos han mostrado ser muy efectivos en pacientes en fase aguda de la enfermedad, sin embargo, su eficacia en la fase crónica está bajo estudio y existen ciertas controversias sobre la misma y consecuentemente sobre su utilización de forma generalizada. Además, estas drogas tienen, frecuentemente, múltiples efectos secundarios caracterizados por manifestaciones digestivas, cutáneas y hematológicas de diferente grado de intensidad. Por lo tanto, los tratamientos quimioterapéuticos actualmente empleados pueden ser altamente tóxicos y poco eficientes en la fase crónica de la enfermedad. Destacar que un importante problema de estos tratamientos es que con ellos la respuesta desencadenada no es suficiente para el aclaramiento total del parásito persistiendo estos durante muchos años en los tejidos del paciente. A este respecto, una molécula eficaz como vacuna "preventiva o terapéutica" debe inducir una respuesta inmunitaria antígeno-específica tanto humoral como celular, desbalanceada hacia un perfil Th1/Tc1, y activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) cuya presencia es crucial para producir el aclaramiento total de T cruzi y por tanto el control de la infección (revisado en Cazorla et al. 2009. Expert Rev Vaccines 88 (7) :922-935; Quijano-Hernández y Dumonteil 2011 Human Vaccine 7 (11) :1184-91) .

En cuanto al diagnóstico de la enfermedad de Chagas, en la actualidad se realiza principalmente mediante técnicas serológicas convencionales como las técnicas de ELlSA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) , inmunofluorescencia indirecta o hemaglutinación, las cuales tienen una alta sensibilidad y especificidad. Los tests comerciales que actualmente se emplean utilizan extractos de proteínas totales del parásito o combinaciones de antígenos recombinantes. Sin embargo, ninguno de estos métodos de diagnóstico es eficaz para determinar el estatus clínico del paciente en su fase crónica, es decir, para diferenciar las distintas fases de la fase crónica de la enfermedad de Chagas (IND, CCC/DIG) . Además, en general, estos sistemas de diagnóstico serológico aunque permiten detectar anticuerpos en suero de pacientes crónicos, resultan poco útiles para evaluar la evolución de los pacientes bajo tratamiento, ya que los niveles de anticuerpos persisten, de forma estable, durante mucho tiempo (en aquellos casos en que el tratamiento funcione pueden llegar a mantenerse más de diez años) . Por último, la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) si bien puede resultar útil para identificar fallo terapéutico cuando la detección de DNA de T cruzi en sangre periférica es positiva, no permite predecir el éxito del tratamiento puesto que incluso la obtención de repetidos resultados de PCR negativos no son indicativos, necesariamente, de cura parasitológica. De hecho, no hay una correlación directa entre resultados de PCR negativos e infección por T cruzi. Por lo tanto, los métodos de diagnóstico disponibles actualmente no permiten detectar la dinámica de respuesta después del tratamiento ni, por tanto, reconocer los casos en que la terapia no es efectiva.

A la vista de lo expuesto, actualmente sigue existiendo la necesidad de identificar moléculas que permitan establecer la dinámica de la respuesta inmunitaria antiparasitaria durante el desarrollo de la enfermedad de Chagas en pacientes infectados por T cruzi y tras el tratamiento. Dichas moléculas son fundamentales para establecer marcadores que permitan diagnosticar la enfermedad y determinar en qué fase crónica de la enfermedad se encuentra el paciente, además de permitir evaluar la eficacia o impacto terapéutico del tratamiento recibido por un paciente. Asimismo, existe la necesidad de identificar epitopos y fragmentos antigénicos capaces de inducir una respuesta CTL antígeno específica capaz de controlar la infección por T cruzi. En este sentido, la presente invención se refiere a un péptido capaz de inducir una respuesta CTL antígeno específica en pacientes con la enfermedad de Chagas y a las aplicaciones del mismo. Ventajas y características adicionales de la invención se harán evidentes de la descripción detallada que sigue.

Objeto de la invención La presente invención se refiere en un aspecto a un péptido (péptido de la invención) caracterizado porque su secuencia aminoacídica se selecciona del grupo formado por: las secuencias SEO ID NO 1, SEO ID NO 2 Y SEO ID NO 3 de la proteína paraflagelar PFR2 de T cruzi, las secuencias SEO ID NO 4, SEO ID NO 5 Y SEO ID NO 6 de la proteína paraflagelar PFR3 de T cruzi y las secuencias que comparten al menos un 80% de homología con las secuencias SEO ID NO 1, SEO ID NO 2, SEO ID NO 3, SEO ID NO 4, SEO ID NO 5 Y SEO ID NO 6.

En otro aspecto, se refiere a una molécula quimérica (molécula quimérica de la invención) formada por la unión de uno o varios péptidos de la invención y una o varias secuencias espaciadoras.

La presente invención se refiere también a una molécula de ADN (molécula de ADN de la invención) que codifica el péptido de la invención o la molécula quimérica de la invención y a un vector que comprende dicha molécula de ADN. Asimismo se refiere a una célula trasformada con dicho vector.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de uno o varios péptidos de la invención, de una o varias moléculas quiméricas de la invención y/o de una o varias molécula de ADN de la invención, como biomarcador para la identificación de la fase de la patología de la enfermedad de Chagas en su fase crónica y para la evaluación del impacto terapéutico de un tratamiento contra la enfermedad de Chagas.

Asimismo, se refiere a una composición farmacéutica (composición farmacéutica de la invención) que comprende uno o varios péptidos de la invención, y/o una o varias moléculas quiméricas de la invención, y/o una o varias moléculas de ADN de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se refiere también al uso de la composición farmacéutica de la invención, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, sola o en combinación con otras inmunoterapias o medicamentos quimioterapéuticos.

La presente invención se refiere en otro aspecto a un método de identificación de la fase de la enfermedad de Chagas en su fase crónica (primer método de identificación de la fase de la patología de la enfermedad de Chagas de la invención) que comprende:

a) incubar uno o varios péptidos y/o una o varias moléculas quiméricas de la invención con una muestra de células mononucleares aisladas de un individuo... [Seguir leyendo]

1. Péptido caracterizado porque su secuencia aminoacidica se selecciona del grupo formado por la secuencia SEO ID NO 3 de la proteína paraflagelar PFR2 de Tr y panosoma cruzi y las secuencias que comparten al menos un 80% de homologla con la secuencia SEO ID NO 3.

2. Péptido según la reivindicación 1 cuya secuencia aminoac1dica es la secuencia SEO ID NO 3.

3. Molécula quimérica formada por la unión de uno o varios péptidos según la reivindicación 1 ó 2 y una o varias secuencias espaciadoras.

4. Molécula quimérica según la reivindicación 3, que además comprende uno o varios adyuvantes y/o uno o varios fragmentos proteicos con o sin capacidad inmunogénica.

5. Molécula quimérica según la reivindicación 3 ó 4 que comprende además, uno o varios péptidos seleccionados del grupo formado por los péptidos de secuencia SEO ID NO 1, SEO ID NO 2, SEO ID NO 4, SEO ID NO 5, SEO ID NO 6 Y los péptidos cuyas secuencias comparten al menos un 80% de homología con la secuencia SEO ID NO 1, SEO ID NO 2, SEO ID NO 4, SEO ID NO 5 Y SEO ID NO 6.

6. Molécula quimérica según la reivindicación 3 ó 4 que comprende además al menos un péptido de secuencia SEO ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEO ID NO 6 o un péptido cuya secuencia comparte al menos un 80% de homología con la secuencia SEO ID NO 4, SEO ID NO 5 o SEO ID NO 6.

7. Molécula quimérica, según la reivindicación 6, formada por la unión de la secuencia SEO ID NO 3 o una secuencia con al menos un 80% de homologia con la secuencia SEO ID NO 3 Y la secuencia SEO ID NO 6 o una secuencia con al menos un 80% de homología con la secuencia SEO ID NO 6.

8. Molécula quimérica según la reivindicación 7, que además comprende el péptido de secuencia SEO ID NO 1

o una secuencia con al menos un 80% de homología con la secuencia SEO ID NO 1.

9. Molécula de ADN que codifica un péptido según la reivindicación 1 ó 2, o una molécula quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8.

10. Vector que comprende una molécula de ADN según la reivindicación 9.

11. Célula transformada con un vector según la reivindicación 10.

12. Uso de un péptido según la reivindicación 1 ó 2, de una molécula quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, o de una molécula de ADN según la reivindicación 9, como biomarcador para la identificación de la fase de la patología de la enfermedad de Chagas en su fase crónica y para la evaluación del impacto terapéutico de un tratamiento contra la enfermedad de Chagas.

13. Composición farmacéutica que comprende uno o varios péptidos según la reivindicación 1 ó 2, y/o una o varias moléculas quiméricas según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, y/o una o varias moléculas de ADN según la reivindicación 9, y un vehiculo farmacéuticamenle aceptable.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación anterior que comprende además otro principio activo o medicamento quimioterapéutico y/u otras moléculas inmunoterapéuticas.

15. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 13 ó 14, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, sola o en combinación con otras moléculas inmunoterapéuticas o medicamentos quimioterapéuticos.

16. Método de identificación de la fase de la patología de la enfermedad de Chagas en su fase crónica que comprende:

a) incubar uno o varios péptidos según la reivindicación 1 ó 2, y/o una o varias moléculas quiméricas según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 con una muestra de células mononucleares aisladas de un individuo con enfermedad de Chagas, y

b) medir la concentración de 'citocinas proinflamatorias y el nivel de actividad citotóxica en dicha muestra,

donde una mayor concentración de cítocinas-pro inflamatorias y la presencia de células con actividad citotóxica péptido-específica, frente a los valores detectados en células del mismo paciente no estimuladas, se asocia con la fase crónica indeterminada de la enfermedad.

17. Método, según la reivindicación 16, donde la concentración de citocinas proinflamatorias se determina mediante un ensayo multiplex y la actividad citotóxica mediante un ensayo ELlSPOT para la determinación de Granzima B.

18. Método para la evaluación del impacto terapéutico de un tratamiento contra la enfermedad de Chagas que comprende las siguientes etapas:

A) incubar uno o varios péptídos según la reivindicación 1 ó 2, y/o una o varias moléculas quiméricas según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 con una muestra de células mononucleares aisladas de un individuo con la enfermedad de Chagas pre-tratamiento y con una muestra de células mononucleares aisladas de un individuo con la enfermedad de Chagas post-tratamiento, y

B) medir el nivel de linfocitos T CD8+ péptido-específicos y/o molécula quimérica-especificos en la muestra pre-tratamiento yen la muestra post-tratamiento, donde un mayor porcentaje de linfocitos T CD8+ péptido-específicos y/o molécula quimérica-específicos en la muestra post-tratamiento que en la muestra pre-tratamiento se asocia con la efectividad del tratamiento recibido.

19. Kit que comprende un pépfido según la reivindicación 1 ó 2, una molécula quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, y/o una molécula de ADN según fa reivindicación 9, para llevar a cabo un método según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

20. Uso del kit según la reivindicación 19 para la identíficación de la fase de la patología de la enfermedad de Chagas en su fase crónica y/o para la evaluacíón del impacto terapéutico de un tratamiento contra la enfermedad de Chagas.

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consejo superior de Investigaciones científicas Biomarcadores de la enfermedad de chagas 097/12 6

10 PRT Artificial sequence

péptido PFR2 19-28

1

Pro Glu val 5 Thr ASp val Thr Leu 10

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15. 163

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44. 457

5

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48. 489

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