Procedimiento de bioanálisis de moléculas de ácido nucleico en una muestra y biosensor para su implementación.

Procedimiento de bioanálisis de un tipo seleccionado de molécula de ácido nucleico en una muestra,

que comprende la etapa de:

a) poner una superficie receptora de un elemento transductor mecánico en contacto con la muestra, comprendiendo dicha superficie receptora una capa bioactiva de ácidos nucleicos dispuesta para interaccionar con una molécula de ácido nucleico diana, de modo que, tras el contacto con la muestra, dicha capa bioactiva de ácidos nucleicos se convierte en una capa bioactiva modificada debido a la interacción con las moléculas de ácido nucleico de la muestra;

caracterizado porque el procedimiento comprende además las etapas de:

b) variar la temperatura de la capa bioactiva modificada de manera que se produce un cambio en al menos un rasgo mecánico de dicha capa bioactiva modificada, produciendo así un cambio de al menos un rasgo de dicho elemento transductor mecánico;

c) medir dicho rasgo de dicho elemento transductor mecánico para obtener datos relativos a dicho rasgo de dicho elemento transductor mecánico correspondientes, al menos, a dos temperaturas diferentes de dicha capa bioactiva modificada, seleccionándose dichas temperaturas para no producir ninguna eliminación de la molécula de ácido nucleico diana de la capa bioactiva modificada;

d) determinar, basándose en dichos datos, al menos una característica de la muestra.

e) modificar la humedad relativa a la que se expone la capa bioactiva modificada; y

f) llevar a cabo la etapa c) de modo que comprende medir dicho rasgo de dicho elemento transductor mecánico para obtener dichos datos relativos a dicho rasgo de dicho elemento transductor mecánico correspondientes, al menos, a dos temperaturas diferentes, para al menos dos humedades relativas diferentes.

Procedimiento de bioanálisis de moléculas de ácido nucleico en una muestra y biosensor para su implementación Campo de la invención La invención se refiere al campo de biosensores de ácidos nucleicos. Más específicamente, se refiere a un procedimiento de bioanálisis de un tipo seleccionado de molécula de ácido nucleico en una muestra en base al comportamiento de un elemento de oro/silicio funcionalizado con capas de ácido nucleico cuando se somete a ciclos de temperatura, siendo el comportamiento de las capas diferente cuando la molécula diana está en la muestra (cuando hay hibridación) o no. El procedimiento de la invención también puede distinguir la presencia de apareamientos erróneos únicos en las moléculas diana. La invención también se refiere al sistema para llevar a cabo el procedimiento de la invención.

Estado de la técnica Los biosensores de ácidos nucleicos son herramientas importantes en diferentes áreas tales como biología molecular y genómica funcional. Por ejemplo, cada vez se han vuelto más útiles para la detección de enfermedades y patógenos.

En el campo específico de los biosensores de ácidos nucleicos, un tipo muy conocido de biosensor de ácidos nucleicos se basa en la inmovilización de una capa de ácidos nucleicos (algunas veces denominada sonda de ácido nucleico) , con una secuencia elegida para unirse específicamente a una molécula diana, sobre un soporte sólido. Entonces se expone esta capa a una muestra en la que pueden estar presentes las moléculas diana (ácidos nucleicos complementarios) . Habitualmente, tras la exposición de la superficie del sensor a la muestra, se aclara cuidadosamente el sensor con diferentes disoluciones tampón con el fin de eliminar moléculas que no son diana que pueden haber interaccionado con la sonda de ácido nucleico. También es común usar la temperatura para eliminar esta clase de interacciones no específicas.

Por ejemplo, si la sonda de ácido nucleico comprende un ADN monocatenario (ADNmc) , las moléculas que se unirán al mismo con mayor afinidad serán ADN monocatenario con la secuencia complementaria (según las reglas de Watson-Crick, A con T y G con C) . Sin embargo, habitualmente las muestras son una compleja mezcla de secuencias diferentes de ADNmc (o ARN) que pueden contener regiones que pueden ser complementarias a una región de la sonda de ADN monocatenario. Esto da lugar a la formación de uniones no específicas entre la sonda y moléculas que no son diana. Dado que la fuerza de estas uniones tiende a ser más débil que las uniones entre la sonda y las moléculas diana, el control de la temperatura es útil para desprender las moléculas que no son diana de la sonda de ácido nucleico, es decir, de la superficie del biosensor. Por tanto se aumenta la temperatura hasta un valor algo inferior a la “temperatura de fusión” de la unión sonda-y-diana, “desprendiendo” o “eliminando” así sólo las moléculas que no son diana. Se ha encontrado que esta clase de control de la temperatura es útil para distinguir la presencia de moléculas diana de la presencia de secuencias con un apareamiento erróneo único con la sonda de ADN.

Actualmente se usan sensores de ácidos nucleicos en formatos de matriz (con frecuencia denominados matrices de ADN) , de tal manera que se inmovilizan miles de sondas de ácidos nucleicos sobre soporte sólido usando técnicas de microdispensación. Por tanto, se puede estudiar por ejemplo la expresión génica diferencial entre células sanas y células enfermas y se pueden determinar los genes responsables de una enfermedad.

La detección de la interacción entre las sondas de ácidos nucleicos sobre el soporte sólido y las moléculas complementarias (tales como las moléculas diana) se realiza con frecuencia mediante microscopía de fluorescencia. Esto requiere un tratamiento previo de la muestra con tintes fluorescentes.

Recientemente, el uso de microsoportes flexibles tales como micropalancas ha hecho posible medir la unión entre ácidos nucleicos complementarios directamente, sin necesidad de marcadores fluorescentes. De ese modo, se puede ahorrar tiempo y dinero, y se puede reducir el riesgo de errores humanos en la tediosa etapa de etiquetar la muestra. En estos dispositivos de microsoporte, se miden las interacciones biológicas mediante la flexión, la deformación, el alargamiento y/o propiedades resonantes del soporte flexible.

Estos sistemas de microsoporte incluyen sistemas basados en palancas que tienen un extremo fijo y un extremo móvil; en estos sistemas, habitualmente lo que se detecta es el desplazamiento y/o movimiento del extremo “libre”. Sin embargo, también hay sistemas basados en palancas sujetas en ambos extremos, en los que se puede detectar el movimiento de la parte central. Además, hay otras micro y nanoestructuras mecánicas que son móviles y flexibles, tales como paletas con doble sujeción cuya dirección de movimiento “fácil” corresponde a la torsión de la paleta alrededor del eje de las bisagras que conectan la paleta a un marco (básicamente, como una raqueta cuadrada sujeta a un marco mediante dos mangos opuestos de la raqueta, que se extienden a lo largo de un eje) . Otros sistemas conocidos utilizan membranas que están conectadas a un marco a través de dos conjuntos de bisagras, lo que permite dos grados angulares de libertad. En sensores químicos/biológicos basados en esta clase de sistemas, la superficie del micro o nanoelemento mecánico se sensibiliza con las moléculas de receptor o “sonda” que reconocen selectivamente la sustancia a la que se dirigen. Por tanto, la interacción entre la sonda inmovilizada y la sustancia a la que se dirige sobre la superficie del micro o nanoelemento mecánico produce un cambio de la forma, el perfil, el alargamiento, el esfuerzo y/o el movimiento (vibración) del elemento mecánico. Este cambio se controla habitualmente midiendo el desplazamiento de una parte representativa del elemento mecánico (habitualmente el extremo libre de una micropalanca con una única sujeción, aunque también puede ser el centro de una micropalanca con doble sujeción, una parte de una lámina de membrana, etc.) . Este desplazamiento puede ser del orden de aproximadamente 1-100 nanómetros (nm) y en muchos casos es necesario obtener una resolución mejor que 1 nm, dependiendo de la aplicación. Para la lectura del desplazamiento, hay varias técnicas tales como detección capacitiva, detección basada en la corriente túnel, interferometría óptica, lectura piezorresistente y la técnica de desviación del haz óptico.

Se divulgan ejemplos de MMS (micro o nanosistemas mecánicos) y sistemas de micropalanca, por ejemplo en:

Engel et al, “Atomic force microscopy: a powerful tool to observe biomolecules at work”, Trends in Cell Biology, volumen 9, págs. 77-80 (1999) .

P. Vettiger et al, “The millipede-more than one thousand tips for future AFM storage”, IBM J. Res. Develop., volumen 44, número 3, págs. 323-339 (2000) .

Documento WO-A-2001/33226

Documento WO-A-2003/091458

Documento WO-A-2005/086172

Documento WO-A-2007/006834

Con frecuencia, el rasgo mecánico (características de vibración, desplazamiento del haz) se controla en tiempo real durante el desarrollo de la interacción entre las moléculas de sonda inmovilizadas y la diana o cuando se rompe la interacción. Un ejemplo típico es la detección de los cambios en el rasgo mecánico mientras se pone la sonda en contacto con la muestra (normalmente, un fluido que puede contener las moléculas diana) y las moléculas diana se unen a la sonda. Otro ejemplo es la realización de experimentos de fusión con ADN, en los que se observa un rasgo mecánico mientras se aumenta la temperatura hasta o más allá de la temperatura para la separación de ciertas cadenas de ADN, mediante lo cual se produce el desprendimiento de las moléculas diana (Nanomechanical Detection of DNA Melting on Microcantilever Surfaces; S.L. Biswal, D. Raorane, A. Chaiken, H. Birecki, A. Majumdar, Analytical Chemistr y 78, 7104-7109 (2006) ) .

Ahora bien, los sistemas de la técnica anterior parecen implicar ciertos problemas. Por ejemplo:

- Algunas veces, el “cambio” detectado en el rasgo mecánico (tal como el desplazamiento de una parte de un elemento mecánico) surge debido a otros factores y no debido a la interacción entre la superficie receptora y las moléculas diana. Por ejemplo, el cambio se puede producir mediante interacciones no específicas de moléculas que no son diana con la sonda, pequeñas variaciones en la temperatura, pequeñas fluctuaciones en las concentraciones de iones en la muestra líquida, turbulencias fluidas,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de bioanálisis de un tipo seleccionado de molécula de ácido nucleico en una muestra, que comprende la etapa de:

a) poner una superficie receptora de un elemento transductor mecánico en contacto con la muestra, comprendiendo dicha superficie receptora una capa bioactiva de ácidos nucleicos dispuesta para interaccionar con una molécula de ácido nucleico diana, de modo que, tras el contacto con la muestra, dicha capa bioactiva de ácidos nucleicos se convierte en una capa bioactiva modificada debido a la interacción con las moléculas de ácido nucleico de la muestra;

caracterizado porque el procedimiento comprende además las etapas de:

b) variar la temperatura de la capa bioactiva modificada de manera que se produce un cambio en al menos un rasgo mecánico de dicha capa bioactiva modificada, produciendo así un cambio de al menos un rasgo de dicho elemento transductor mecánico;

c) medir dicho rasgo de dicho elemento transductor mecánico para obtener datos relativos a dicho rasgo de dicho elemento transductor mecánico correspondientes, al menos, a dos temperaturas diferentes de dicha capa bioactiva modificada, seleccionándose dichas temperaturas para no producir ninguna eliminación de la molécula de ácido nucleico diana de la capa bioactiva modificada;

d) determinar, basándose en dichos datos, al menos una característica de la muestra.

e) modificar la humedad relativa a la que se expone la capa bioactiva modificada; y

f) llevar a cabo la etapa c) de modo que comprende medir dicho rasgo de dicho elemento transductor mecánico para obtener dichos datos relativos a dicho rasgo de dicho elemento transductor mecánico correspondientes, al menos, a dos temperaturas diferentes, para al menos dos humedades relativas diferentes.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los ácidos nucleicos presentes en la muestra o que constituyen la capa bioactiva son aptámeros, moléculas de ADN, ARN o ANP.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho cambio en un rasgo mecánico de dicha capa bioactiva modificada comprende una contracción de la capa bioactiva modificada cuando se aumenta la temperatura, y/o una expansión de la capa bioactiva modificada cuando se reduce la temperatura.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, al menos durante las etapas b) y c) , el elemento mecánico está dispuesto en una atmósfera gaseosa y/o a vacío.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la característica de la muestra determinada en la etapa d) es la presencia o ausencia de la molécula de ácido nucleico diana en la muestra, y/o la concentración de la molécula de ácido nucleico diana en la muestra, y/o la presencia y/o las concentraciones de cualquier molécula diana que tiene al menos un apareamiento erróneo con respecto a las moléculas de ácido nucleico dispuestas en la capa bioactiva.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura de la capa bioactiva modificada es controlada mediante el control de al menos un rasgo de luz dirigida sobre dicho elemento mecánico.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se usa una matriz de dichos elementos transductores mecánicos, estando dotados al menos algunos de los elementos transductores mecánicos de dicha matriz de capas bioactivas de ácidos nucleicos que se diferencian de las capas bioactivas de ácidos nucleicos de otros elementos transductores mecánicos de dicha matriz.