Atividad de fosfodiesterasa y regulación de la señalización mediada por fosfodiesterasa 1-B en el cerebro.

Método in vitro para identificar un compuesto que modula la fosforilación de Thr34 de DARPP-32en una célula o tejido que consiste en:

(a) poner en contacto dicha célula o tejido con un compuesto de ensayo; y

(b) determinar un nivel de actividad de PDE1B de dicha célula o tejido;

donde una diferencia en dicho nivel y un nivel de control de la actividad de PDE1B en unacélula o tejido comparable que no ha entrado en contacto con el compuesto de ensayo esindicativo de la capacidad de dicho compuesto para modular la fosforilación de Thr34 deDARPP-32.

1. CAMPO TÉCNICO

La presente invención hace referencia a métodos para identificar compuestos que modulan la fosforilación de TR34 de DARP 32.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Los nucleótidos cíclicos y el calcio son los principales segundos mensajeros de las vías de transducción de señal en el área del cerebro conocida como ganglios basales o núcleo estriado. La activación del receptor de glutamato del tipo NMDA y/o la activación del receptor de dopamina D2 tiene como resultado concentraciones de calcio intracelular aumentadas (Greengard, P. et al. 1999. Neuron 23:435-447; Kotter, R. 1994. Prog. Neurobiol. 44:163-196) lo que lleva a la activación de efectores como quinasa II dependiente de calmodulina (CaMKII) y calcineurina y, de forma potencial, a la activación de fosfodiesterasas dependientes de camodulina (CaM-PDE) y calcio. La activación del receptor de dopamina D1 o D2 lleva a la activación de adenilil ciclasa (y cAMP aumentado) o inhibición (y cAMP disminuido) , respectivamente. La concentración intracelular de cGMP también se aumenta tras la activación del receptor de dopamina D1 y queda igual o inhibido tras la activación del receptor D2. Los nucleótidos cíclicos activan la proteína quinasa A (PKA; proteína quinasa dependiente del cAMP) y/o proteína quinasa G (PKG; proteína quinasa dependiente del cGMP) que fosforilan elementos posteriores a la vía de transducción de señal como DARPP-32 (fosfoproteína regulada por cAMP y dopamina) y la proteína que une el elemento de respuesta de cAMP (CREB) . Estas vías de señalización se infrarregulan con fosfodiesterasas (PDE) mediante hidrólisis de los nucleótidos cíclicos a sus 5’-monofosfatos. Por lo tanto, las PDE reguladas por calcio que hidrolizan cAMP y/o cGMP son interfaces potenciales entre vías de señalización intracelular reguladas por

dopamina y otras vías en los ganglios basales (núcleo estriado) , que incluyen, sin carácter limitativo, vías de señalización intracelular de óxido nítrico, norepinefrina, neurotensina, CCK, VIP, serotonina, glutamato (p. ej., receptor NMDA, receptor AMPA) , GABA, acetilcolina, adenosina (p. ej., receptor A2A) , receptor cannabinoide, péptido natriurético (p. ej., ANP, BNP, CNP) o endorfina. [0003] La potenciación a largo plazo y la depresión a largo plazo, las principales formas de plasticidad asociadas a la memoria y aprendizaje mediado por el hipocampo, también se regulan mediante cascadas de transducción de señal de calcio/calmodulina y nucleótidos cíclicos, incluyendo la actividad de PKA (Abel, T. et al. 1997. Cell 88:615-626; Skoulakis, E.M.C. et al. 1993. Neuron 11:197-208) , CaMKII (Bach, M.E. et al. 1995. Cell 81:905-915; Mayford, M. et al. 1995. Cell 81:891904) , CREB (Bourtchuladze, R. et al. 1994. Cell 79:59-68; Guzowski, J.F. et al. 1997. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 94:2693-2698; Yin, J.C.P. et al. 1994. Cell 79:49-58) , y calcineurina (Mansuy, I.M. et al. 1998. Cell 92:39-49) . Los mutantes de drosophila han mostrado niveles intracelulares de cAMP cambiados o una vía de señalización de cAMP cambiada con el concomitante déficit de aprendizaje en un paradigma de condicionamiento olfativo. (Qui, Y. y R.L. Davis. 1993. Genes Dev. 7:1447-1458; Livingstone, M.S. et al. 1984. Cell 37:205-215; Skoulakis, E.M.C. et al. 1993. Neuron 11:197-208;

Davis, R.L. et al. 1995. Mol. Cell. Biochem. 149/150:271-278) . La actividad de cGMP también se ha visto implicada en el aprendizaje y la memoria a través de la vía de óxido nítrico de la transducción de señal retrógrada (Gally, J.A. et al. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3547-3551; Garthwaite, J. 1991. Trends Neurosci. 14:60-67) . [0004] Se han identificado diez familias de PDE pero solo se ha mostrado que la Familia I, las

fosfodiesterasas dependientes de calmodulina (CaM-PDE) , actúe como un punto potencial de interacción entre las vías de señalización de nucleótidos cíclicos y calcio. Los tres conocidos genes CaM-PDE, PDE1A, PDE1B y PDE1C, se expresan en el tejido del sistema nervioso central. PDE1A se expresa a través del cerebro con niveles mayores de expresión en las capas CA1 a CA3 del hipocampo y el cerebelo y a un nivel bajo en el núcleo estriado (Borisy, F.F. et al. 1992. J. Neurosci.

12:915-923; Yan, C. et al. 1994. J. Neurosci. 14:973-984) . PDE1 B se expresa principalmente en el núcleo estriado, giro dentado, tracto olfativo y cerebelo y su expresión se ha relacionado con las regiones del cerebro que tienen altos niveles de inervación dopaminérgica (Furuyama, T. et al. 1994. Mol. Brain Res. 26:331-336; Polli, J.W. y R.L. Kincaid. 1994. J. Neurosci. 14:1251-1261; Yan, C. et al. 1994. J. Neurosci. 14:973-984) . PDE1C se expresa principalmente en el epitelio olfativo, células granulosas cerebelosas y el núcleo estriado (Yan, C. et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:96779681; Yan, C. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271:25699-25706) . Mientras que los patrones de expresión se han estudiado de forma extensa, no se ha establecido un papel fisiológico para las CaM-PDE en el cerebro. [0005] Kakkar et al (1999. CMLS, 55, 1164-1186) revelan que deprenilo, un inhibidor de PDE1B,

mejora los síntomas de la enfermedad de Parkinson entre otros, potenciando la acción de L-dopa. [0006] Polli et al (1994. J Neurosci, 14 (3) , 1251-1261) revelan una coincidencia de los resultados de los experimentos de hibridación de PDE1B1 in situ con la expresión del ARNm del receptor de dopamina D1. [0007] WO9920273 revela un método de detección para agentes que modulan la fosforilación de Thr34 de DARPP-32. El método analiza el efecto del agente directamente sobre fosfo-Thr34 de DARPP añadido al análisis. [0008] Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de proporcionar nuevos métodos de detección que pueden usarse para desarrollar composiciones o medicamentos innovadores que puedan usarse para tratar enfermedades o trastornos relacionados con la regulación de fosfodiesterasas en el

sistema nervioso. Además, existe la necesidad de desarrollar tratamientos para dichas enfermedades o trastornos que se deben, al menos en parte, a una anormalidad o desarreglo de una vía de señalización intracelular regulada por fosfodiesterasas. La presente invención proporciona dichos métodos y composiciones. [0009] La mención o identificación de cualquier referencia en la sección 2, o en cualquier otra sección de esta solicitud, no debería considerarse una afirmación de que dicha referencia está disponible como técnica precedente a la presente invención.

3. RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0010] La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento, por parte de los inventores, de que la actividad de fosfodiesterasa (PDE) , en concreto, la actividad de fosfodiesterasa 1B (PDE1B) , funciona en el tejido cerebral como un regulador de la actividad locomotora y el aprendizaje y la memoria. Como antecedentes, PDE1B puede usarse como diana terapéutica para la regulación de las vías de señalización intracelulares, preferiblemente en el sistema nervioso, incluyendo, sin carácter limitativo, una vía de señalización intracelular del receptor de dopamina D1, receptor de dopamina D2, óxido nítrico, norepinefrina, neurotensina, CCK, VIP, serotonina, glutamato (p. ej., receptor NMDA, receptor AMPA) , GABA, acetilcolina, adenosina (p. ej., receptor A2A) , receptor cannabinoide, péptido natriurético (p. ej., ANP, BNP, CNP) o endorfina. En modos preferidos, PDE1B puede usarse como diana terapéutica para el tratamiento de, p. ej., un trastorno relacionado con PDE1B o un trastorno de la vía intracelular del receptor de dopamina D1. En un modo específico, PDE1B puede usarse como diana terapéutica para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Como antecedentes, la invención muestra un método para modular la actividad de PDE1B en una célula o tejido que consiste en poner en contacto dicha célula o tejido con una cantidad de un compuesto suficiente para modular la actividad de una vía de señalización intracelular de dopamina D1, donde el contacto de dicha célula o tejido con el compuesto tiene como resultado la modulación de la actividad de PDE1B. En determinados modos, el compuesto se une a PDE1B. En otros modos,

el compuesto cambia la expresión de PDE1B. En otros modos, se modula la fosforilación de fosfo-Thr34 de DARPP-32 (de aquí en adelante “fosfo-Thr34”) o fosfo-Ser845 del receptor AMPA GluR1 (de aquí en adelante “fosfo-Ser845”) . [0012] Como antecedentes, la invención también muestra un método para tratar un trastorno, incluyendo sin carácter limitativo, un trastorno relacionado con PDE1B y un trastorno de la vía de señalización intracelular del receptor de dopamina D1, en un paciente que lo necesite, que consiste en administrar... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para identificar un compuesto que modula la fosforilación de Thr34 de DARPP-32 en una célula o tejido que consiste en:

(a) poner en contacto dicha célula o tejido con un compuesto de ensayo; y

(b) determinar un nivel de actividad de PDE1B de dicha célula o tejido; donde una diferencia en dicho nivel y un nivel de control de la actividad de PDE1B en una célula o tejido comparable que no ha entrado en contacto con el compuesto de ensayo es indicativo de la capacidad de dicho compuesto para modular la fosforilación de Thr34 de DARPP-32.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la fosforilación de Ser845 del receptor AMPA GluR1 también se modula.

3. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 donde la diferencia en la actividad de PDE1B es indicativo de la capacidad de dicho compuesto de ensayo para modular la activación dependiente de la fosforilación de DARPP-32 o DARPP-32 y Ser845 del receptor AMPA GluR1.

4. Método para elegir un agente terapéutico potencial para usarlo en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, trastorno por déficit de atención (TDA) , trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) , enfermedad neurodegenerativa, síndrome de Tourette, tic nervioso, síndrome de Lesch-Nyhan, dolor, distonías, abuso de drogas

o sustancias, esquizofrenia, trastorno esquizoafectivo, depresión, trastorno afectivo, trastorno bipolar, trastorno obsesivo-compulsivo, trastorno de la conducta alimentaria, vómito, trastorno de pánico, trastorno de ansiedad, migraña, mioclono, síndrome premenstrual (SPM) , trastorno por estrés postraumático, síndrome carcinoide, enfermedad de Alzheimer, derrame cerebral, epilepsia, trastorno del ritmo circadiano o del sueño (p. ej. insomnio) , disfunción sexual, trastorno por estrés, hipertensión y cáncer, que consiste en:

(a) determinar un primer nivel de actividad de PDE1B y de fosforilación de Thr34 de DARPP-32 en un animal no humano;

(b) administrar un agente terapéutico potencial a dicho animal;

(c) determinar un segundo nivel de actividad de PDE1B y de fosforilación de Thr34 de DARPP-32 en dicho animal;

(d) comparar la respuesta de dicho animal con la de un animal de control al que no se le ha administrado el agente terapéutico potencial.

(e) elegir un agente terapéutico potencial basándose en la diferencia en las respuestas observadas y en los niveles de actividad de PDE1B y de fosforilación de Thr-32 de DARPP32 entre dicho animal y dicho animal de control.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4 donde el animal es un ratón.

6. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 o 5 en el que el trastorno es la enfermedad de Parkinson.

GEN PDE1B

GEN PDE1B DIANA