Aptámero contra midkina y uso del mismo.

Un aptámero que posee actividad inhibidora contra midkina, que es o bien (a) o (b) a continuación:

(a) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las SEC ID NÚM: 1 a 2, 4 a 20,22 a 33, 35 a 36, 39 a 64 y 66 a 70, con la salvedad que el uracilo puede ser timina, en donde los nucleótidoscontenidos en el aptámero son tales que,

(i) las posiciones 2' de los nucleótidos de pirimidina, ya sean idénticos o diferentes, son átomos de flúor o estánsustituidas por átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en átomos de hidrógeno, grupos hidroxi ygrupos metoxi, y

(ii) las posiciones 2' de los nucleótidos de purina, ya sean idénticos o diferentes, son grupos hidroxi o estánsustituidas por átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en átomos de hidrógeno, grupos metoxi yátomos de flúor;

(b) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las SEC ID NÚM: 1 a 2, 4 a 20,22 a 33, 35 a 36, 39 a 64 y 66 a 70, con la salvedad que el uracilo puede ser timina, en donde uno a tres nucleótidosestán sustituidos, eliminados, insertados o añadidos, en donde los nucleótidos contenidos en el aptámero son talesque,

(i) las posiciones 2' de los nucleótidos de pirimidina, ya sea idénticos o diferentes, son átomos de flúor o estánsustituidas por átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en átomos de hidrógeno, grupos hidroxi ygrupos metoxi, y

(ii) las posiciones 2' de los nucleótidos de purina, ya sea idénticos o diferentes, son grupos hidroxi o están sustituidaspor átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en átomos de hidrógeno, grupos metoxi y átomos deflúor.

Aptámero contra midkina y uso del mismo.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un aptámero contra midkina, a un método para utilizarlo y similares.

Antecedentes de la invención La midkina (en lo sucesivo abreviada "MK" según sea necesario) es un factor de crecimiento/diferenciación que se descubrió primero como un producto génico expresado transitoriamente en el proceso de inducción de diferenciación de células tumorales embrionarias (EC) con ácido retinoico, siendo un polipéptido que tiene un peso molecular de 13kDa, rico en aminoácidos básicos y cisteína (véanse, por ejemplo, el documento no patente 1 y el documento no de patente 2) .

La estructura estérica de MK ha sido determinada por RMN y ha sido descrita (véase, por ejemplo, el documento no de patente 3) . Cuando se caracteriza estructuralmente, la MK se configura principalmente con dos dominios. Específicamente, la MK consiste en un fragmento en el lado N-terminal que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 52 (en lo sucesivo denominado "el fragmento N-terminal") , un fragmento en el lado C-terminal que consiste en los residuos de aminoácidos 62 a 121 (en lo sucesivo denominado "el fragmento C-terminal") y una región de bucle que conecta los fragmentos (residuos de aminoácidos 53 a 61) . Unido a la parte externa de cada dominio hay un extremo rico en aminoácidos básicos. En la molécula de MK, cada fragmento N-terminal y cada fragmento Cterminal tiene una estructura estérica que consiste principalmente en tres estructuras de lámina º invertidas (en lo sucesivo denominadas "dominios"; un dominio que consiste en los residuos de aminoácidos 15 a 52 en el fragmento N-terminal denominado "el dominio N", un dominio que consiste en los residuos de aminoácidos 62 a 104 en el fragmento C-terminal denominado "el dominio C") , y estructuras que se mueven libremente y que no asumen ninguna estructura en particular (en lo sucesivo denominadas "colas"; una cola que consiste en los residuos de aminoácidos 1 a 14 en el fragmento N-terminal denominada "cola N" y una cola que consiste en los residuos de aminoácidos 105-121 en el fragmento C-terminal denominada "cola C") .

Los receptores de MK conocidos incluyen la proteína tirosina fosfatasa º (PTPº) de tipo receptora, LRP (proteína relacionada con los receptores de lipoproteína de baja densidad) , ALK (leucemia cinasa anaplásica) , integrina y syndecan, y similares. La MK es una proteína alta y positivamente cargada que contiene grandes cantidades de los aminoácidos básicos lisina (K) y arginina (R) . Tiene un sitio de unión a heparina en su dominio C, y se sabe que se une fuertemente a moléculas negativamente cargadas tales como heparina y sulfato de condroitina E. Como resultado del análisis de mutagénesis y del análisis de RMN, se cree que el grupo I, configurado con K79, R81 y K102, y el grupo II, configurado con K86, K87 y R89, son importantes para la unión con heparina. Mientras tanto, existe un informe que indica que solamente el grupo I es importante para la unión con sulfato de condroitina E. Cuando R81 del grupo I se reemplaza con A, se reduce la actividad de unión con heparina. En consecuencia, se suprimen la reducción de la actividad de unión a PTPº y la extensión y el movimiento de neuritas inducidos por MK.

Algunos factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) poseen un sitio de unión a heparina. Se cree que estos factores de crecimiento se unen a proteoglicano de heparán sulfato, una matriz extracelular, permanecen en las posiciones apropiadas y son liberados según sea necesario. También se sabe que los mismos se unen a heparán sulfato expresado en las células nerviosas y en células endoteliales vasculares para contribuir a la actividad fibrinolítica y de extensión de neuritas. Cuando se recubre una placa Petri con MK y se siembran allí células nerviosas de embrión de ratón, se extienden las neuritas. En esta situación, la digestión de las células nerviosas con heparitinasa suprime la extensión de neuritas. Mientras tanto, cuando las células endoteliales vasculares se cultivan y se añade MK, la actividad del activador de plasminógeno de las células se eleva. En este caso también la digestión de las células con heparitinasa suprime la elevación de la actividad del plasminógeno.

Se cree que la MK se une a PTPº en dos sitios. Un sitio implica un enlace de gran afinidad con sulfato de condroitina (Kd = 0, 58 nM) . Est enlace desaparece tras la digestión con condroitinasa. El otro sitio implica un enlace con proteína, siendo un enlace de baja afinidad que permanece después de la digestión con condroitinasa (Kd = 3 nM) . La MK promueve la migración de células nerviosas fetales que expresan PTPº; el tratamiento de células nerviosas con condroitinasa ABC suprime la migración. Las células UMR106 de tipo osteoblastos expresan PTPº y se sabe que su migración dependiente de MK se suprime con el tratamiento con condroitinasa ABC. La migración dependiente de MK de macrófagos también se suprime con el tratamiento con condroitinasa ABC, condroitinasa B o heparinasa. Ya que no se cree que los macrófagos expresen PTPº, se cree que está implicado otro receptor.

De cualquier forma, la carga negativa no se une al sitio de unión a heparina de MK. Cuando se inmovilizó MK por aminoacoplamiento y se sometió a análisis por resonancia de plasmones, los resultados obtenidos demostraron que el sulfato de condroitina E y la heparina se unieron fuertemente a MK, mientras que los sulfatos de condroitina A, B, C y D no se unieron a ésta.

Se sabe que la MK posee un amplio espectro de actividades biológicas. Por ejemplo, se sabe que en células cancerosas humanas, aumenta la expresión de MK. Este aumento de expresión se ha observado en una amplia variedad de tipos de cáncer, incluidos cáncer esofágico, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga urinaria, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer de tórax, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de mama, neuroblastoma, glioblastoma, cáncer uterino, cáncer de ovario y tumor de Wilms (véanse, por ejemplo, el documento de patente 1 y el documento no de patente 4) . También se cree que la MK promueve la supervivencia y el movimiento de células cancerosas y facilita la neovascularización para ayudar al avance del cáncer.

También se sabe que la MK es una de las moléculas que cumplen una función central en el proceso de desarrollo de la inflamación.

Por ejemplo, se sabe que la formación de íntima naciente tras daño a los vasos sanguíneos y el inicio de nefritis en lesión isquémica se mitigan en ratones con genes inactivados que carecen del gen de MK. También se sabe que en un modelo de reumatismo, la adhesión posoperatoria también se mitiga en gran medida en ratones con genes inactivados de MK (véanse, por ejemplo, el documento de patente 2, el documento de patente 3 y el documento de patente 4) . En consecuencia, se sabe que la MK está implicada en enfermedades inflamatorias tales como artritis, enfermedades autoinmunitarias, artritis reumática (artritis reumatoidea (RA) , artrosis (OA) ) , esclerosis múltiple, adhesión posoperatoria, colitis inflamatoria, psoriasis, lupus, asma y anomalías funcionales de los neutrófilos. Asimismo, se sabe que la MK promueve el movimiento (migración) de células inflamatorias tales como macrófagos y neutrófilos. Ya que este movimiento es necesario para el desarrollo de inflamación, se cree que cuando se carece de midkina, es poco probable que se manifiesten enfermedades inflamatorias. (Véase, por ejemplo, el documento de patente 5) .

Dado que los niveles de MK aumentan en el fluido peritoneal de mujeres con endometriosis avanzada, y también dado que la MK estimula la proliferación de células intersticiales endometriales cultivadas, se sabe que la MK está implicada en el inicio y el avance de la endometriosis (véase, por ejemplo, el documento de patente 6) .

Asimismo, ya que exhibe acción de engrosamiento de la íntima vascular, se sabe que la MK está implicada en enfermedades vasculares obstructivas tales como restenosis que le sigue a cirugía de reconstrucción vascular, enfermedad obstructiva vascular de las arterias coronarias, enfermedad obstructiva vascular cerebral, enfermedad obstructiva vascular renal, enfermedad obstructiva vascular periférica, arteriosclerosis e infarto cerebral (véase, por ejemplo, el documento de patente 2) .

Se sabe que la migración celular es importante para los mecanismos de infiltración/metástasis de células cancerosas, engrosamiento de la íntima en focos arterioscleróticos, neovascularización y similares. También... [Seguir leyendo]

1. Un aptámero que posee actividad inhibidora contra midkina, que es o bien (a) o (b) a continuación:

(a) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las SEC ID NÚM: 1 a 2, 4 a 20, 22 a 33, 35 a 36, 39 a 64 y 66 a 70, con la salvedad que el uracilo puede ser timina, en donde los nucleótidos contenidos en el aptámero son tales que,

(i) las posiciones 2' de los nucleótidos de pirimidina, ya sean idénticos o diferentes, son átomos de flúor o están sustituidas por átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en átomos de hidrógeno, grupos hidroxi y grupos metoxi, y

(ii) las posiciones 2' de los nucleótidos de purina, ya sean idénticos o diferentes, son grupos hidroxi o están sustituidas por átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en átomos de hidrógeno, grupos metoxi y átomos de flúor;

(b) un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre las SEC ID NÚM: 1 a 2, 4 a 20, 22 a 33, 35 a 36, 39 a 64 y 66 a 70, con la salvedad que el uracilo puede ser timina, en donde uno a tres nucleótidos están sustituidos, eliminados, insertados o añadidos, en donde los nucleótidos contenidos en el aptámero son tales que,

(i) las posiciones 2' de los nucleótidos de pirimidina, ya sea idénticos o diferentes, son átomos de flúor o están sustituidas por átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en átomos de hidrógeno, grupos hidroxi y grupos metoxi, y

(ii) las posiciones 2' de los nucleótidos de purina, ya sea idénticos o diferentes, son grupos hidroxi o están sustituidas por átomos o grupos seleccionados del grupo que consiste en átomos de hidrógeno, grupos metoxi y átomos de flúor.

2. El aptámero según la reivindicación 1, en el que un nucleótido contenido en el aptámero está modificado.

3. Un complejo que comprende el aptámero según la reivindicación 1 o 2 y una sustancia funcional.

4. El complejo según la reivindicación 3, en el que la sustancia funcional es una sustancia de afinidad, una sustancia para etiquetado, una enzima, un vehículo para administración de un fármaco o un fármaco.

5. Un fármaco que comprende el aptámero según la reivindicación 1 o 2, o el complejo según la reivindicación 3 o 4.

6. Un inhibidor de migración celular que comprende el aptámero según la reivindicación 1 o 2, o el complejo según la reivindicación 3 o 4.

7. Un reactivo diagnóstico que comprende el aptámero según la reivindicación 1 o 2, o el complejo según la reivindicación 3 o 4.

8. Un agente de etiquetado que comprende el aptámero según la reivindicación 1 o 2, o el complejo según la reivindicación 3 o 4.

9. Un método in vitro para detectar midkina, que utiliza el aptámero según la reivindicación 1 o 2, o el complejo según la reivindicación 3 o 4.