Anticuerpos de dominio individual capaces de modular la actividad BACE1.

Un anticuerpo de dominio individual, desprovisto de una cadena ligera,

que se une específicamente a BACE1que es capaz de inhibir la escisión de proteína precursora de beta amiloide (APP) como se determina en un ensayocelular.

Anticuerpos de dominio individual capaces de modular la actividad BACE1

Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos de dominio individual con una especificidad para BACE1. Más específicamente, la invención proporciona anticuerpos de dominio variable individual procedentes de camélidos que se unen a BACE1 y que son capaces de inhibir la actividad de BACE1. Dichos anticuerpos se pueden usar para aplicaciones de investigación y médicas. Aplicaciones específicas incluyen el uso de anticuerpos específicos de BACE1 para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención La enfermedad de Alzheimer ("AD") es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta a millones de pacientes de edad avanzada a lo largo del mundo y es la causa más común atención sanitaria doméstica. La AD se caracteriza clínicamente por la pérdida progresiva de memoria, orientación, función cognitiva, juicio y estabilidad emocional. Al aumentar la edad, el riesgo de desarrollar AD aumenta exponencialmente, de manera que a los 85 años aproximadamente se ve afectado un 20-40 % de la población. La memoria y la función cognitiva se deterioran rápidamente en los 5 primeros años posteriores al diagnóstico de una disfunción de leve a moderada y la muerte debida a complicaciones de la enfermedad es una consecuencia inevitable. El diagnóstico definitivo de AD únicamente se puede hacer después de la muerte, basándose en un examen histopatológico del tejido cerebral del paciente. Dos contrastes histológicos de AD son la presencia de ovillos neurofibrilares de proteína tau hiperfosforilada y de placas amiloides proteínicas, ambos en el interior de la corteza cerebral de los pacientes con AD. Las placas amiloides están compuestas principalmente por un péptido de 37 a 43 aminoácidos designado betaamiloide, también referido como beta-amiloide, amiloide beta o Abeta. Ahora está claro que el péptido Abeta procede de una proteína de membrana integral de tipo 1, llamada proteína precursora de beta amiloide (también referida como APP) a través de dos eventos proteolíticos secuenciales. En primer lugar, se hidroliza la APP en el sitio Nterminal de la hélice alfa transmembrana por medio de una enzima proteolítica específica denominada betasecretasa (la proteasa BACE1 unida a membrana) . El producto N-terminal soluble de este evento de escisión difunde fuera de la membrana, dejando atrás el producto de escisión C-terminal asociado a membrana, denominado C99. Posteriormente se hidroliza de manera adicional la proteína C99 dentro de la hélice alfa transmembrana por medio de una enzima proteolítica específica referida como gamma-secretasa. Este segundo evento de escisión libera el péptido Abeta y deja un "raigón" asociado a membrana. El péptido Abeta generado de este modo se segrega desde la célula al interior de la matriz extracelular donde forma finalmente las placas amiloides asociadas con AD. A pesar de la investigación intensa durante los últimos 100 años, el pronóstico de los pacientes con AD es aún el mismo que la de los pacientes hace un siglo, ya que no existe aún ninguna cura real disponible. Existen dos tipos de fármacos aprobados por la U.S. Food and Drug Administration y se usan actualmente en el ámbito clínico para tratar AD: inhibidores de acetilcolinesterasa (AchE) y memantina. Existe una amplia evidencia en la técnica de que el péptido amiloide beta, el principal componente de las placas amiloides que son específicas de la etiología de AD, juega un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad de AD. Por tanto, uno de las estrategias más favoritas para decrecer Aβ consiste en disminuir su producción por medio de inhibidores de γ- y β-secretasa. Una estrategia fue el desarrollo de inhibidores de gamma-secretasa sin embargo dichos inhibidores con frecuencia tienen como resultado efectos secundarios graves ya que la gamma-secretasa está implicada en el procesado proteolítico 45 de al menos 30 proteínas. Otra estrategia atractiva es el desarrollo de inhibidores de BACE1. BACE1 se produce como un prepropéptido. El péptido de señal de 21 aminoácidos produce la translocación de la proteasa al RE donde el péptido señal se escinde y desde donde BACE1 se dirige después a la superficie celular. Tras su paso a través de la red trans-Golgi trans (TGN) , parte de BACE1 se dirige a la superficie celular desde donde se introduce en el interior de los compartimientos endosómicos proximales. Posteriormente, BACE1 bien penetra en una ruta directa de reciclaje hasta la superficie celular o bien se dirige a las vesículas endosómicas lejanas destinadas para los lisosomas o para la TGN. En la TGN podría re-transportarse a la membrana celular. Debido a su prolongada semivida y a su rápida tasa de reciclaje, BACE1 madura puede ir en ciclos múltiples veces entre la superficie celular, el sistema endosómico y la TGN durante el transcurso de su vida útil. El documento US20060034848 divulga la interacción entre BACE1 y LRP y estrategias para interferir con esta interacción para el desarrollo de inhibidores de 55 BACE1. Hussain I y cols. (2007) J. Neurochem. 100: 802-809 divulga un inhibidor de BACE1 no peptídico. En la presente invención los autores de la invención buscaron desarrollar inhibidores alternativos de la actividad de BACE1 a través de la generación de anticuerpos de cadena individual con especificidad por BACE1. En la colección resultante de aglutinantes de BACE1 los autores de la invención han identificado inhibidores de BACE1. En particular, estos anticuerpos de camélido específicos de BACE1 capaces de inhibir la actividad de BACE1 se pueden usar para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Figuras Figura 1: alineación de la secuencia de aminoácidos del dominio variable de los HCAb de dromedario específicos de 65 BACE1 (SEC ID N.ºs: 1-14 y SEC ID N.ºs: 38-43) . Los residuos distintivos de VHH (F/Y37, E/Q44, R45 y G47) están indicados en negrita, mientras que los residuos característicos de un resto-VH (L11, V37, G44, L45 y W47) están marcados en cursiva. Los residuos de cisteína diferentes de los C92 y C22 canónicos están subrayados. La numeración y el agrupamiento de los residuos bien en el armazón o en sus regiones CDR son como se definen por Kabat (Kabat y cols., 1991) .

Figura 2: Capacidad de los diferentes aglutinantes de BACE1 para reconocer su antígeno.

A. Un diagrama RaPID que representa los valores de velocidad cinética kon (M-1s-1) y koff (s-1) para las interacciones nanoanticuerpo-inmunógeno según se determina por medio de resonancia de plasmón superficial (BIAcore) . La proporción de koff con respecto a kon proporciona la constante de disociación o KD. Se midieron las constantes cinéticas a pH 7, 0 (puntos negros) y pH 5, 0 (puntos rojos) . La mayoría de los aglutinantes de BACE1 tienen valores de KD entre 10 y 100 nM en ambas condiciones de pH.

B. Capacidad de los diferentes aglutinantes de BACE1 para extraer BACE1 a partir de lisados celulares. Se incubaron células SOS sometidas a transfección con BACE1 con cantidades iguales (2 μg) de los diversos nanoanticuerpos anti-BACE1 con marcados con His recombinantes. Tras la extracción de los nanoanticuerpos, se sometieron las muestras a SDS-PAGE y se analizaron por medio de prueba de bandas de Western usando anti-BACE1 (ProSci) . Se usaron Nb_BCIILP y Nb_Aβ, producidos frente a beta-lactamasa BCII 569/H (Conrath y cols., 2001a) y péptido Ap respectivamente, como controles negativos. Únicamente, una parte de los nanoanticuerpos, producidos frente a ectodominio de BACE1 no-glucosilado, son capaces de capturar de forma eficaz BACE1 glucosilada a partir de lisados celulares COS.

Figura 3: Efecto de Nb_B26 y Nb_B9 sobre el procesado de APP en células.

A. Representación esquemática de una construcción de ADNc usada para expresar VHH en células de mamíferos.

La estructura consiste en ADNc de VHH, condensado en su extremo C-terminal al péptido de señal de BACE1, para garantizar la translocación de ER y está condensado en su extremo C-terminal a una marca de epítopo-myc.

B. Nb_B9, pero no Nb_B26, afecta negativamente al procesado APP de sitio-β tras la sobre-expresión transitoria. Se sometieron a co-transfección células COS-B1, que expresan de forma estable niveles bajos de BACE1, con APPSw y bien con Nb_B26 o con Nb_B9. Las células de control bien se sometieron a transfección con vector vacío o bien se sometieron a transfección con APPSw solo. Dos días después de la transfección, las células se lisaron y se analizaron los extractos totales de proteína por prueba de bandas de Western usando anti-myc, anti-BACE1 (ProSci) y B63.1, para detectar longitud completa de VHH, BACE1 y APP y CTF (C83 y C99)... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo de dominio individual, desprovisto de una cadena ligera, que se une específicamente a BACE1 que es capaz de inhibir la escisión de proteína precursora de beta amiloide (APP) como se determina en un ensayo 5 celular.

2. El anticuerpo de dominio individual de acuerdo con la reivindicación 1 que procede de camélidos.

3. El anticuerpo de dominio individual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 cuya secuencia de 10 aminoácidos comprende SEC ID N.ºs: 6, 22 o 26.

4. El anticuerpo de dominio individual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para usar como un medicamento.

5. El anticuerpo de dominio individual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para usar en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

6. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de dominio individual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2.

7. El uso de un anticuerpo de dominio individual de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para la fabricación de un medicamento para tratar la enfermedad de Alzheimer.

8. El uso de un anticuerpo de dominio individual cuya secuencia de aminoácidos comprende SEC ID N.ºs: 6, 22 o 26 para la fabricación de un medicamento para tratar la enfermedad de Alzheimer.

Figura 1

< ---- Armazón-1 ---- > < - CDR1 -> < Armazón-2 > < --- CDR2 --- >

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