Anticuerpos anti-P-selectina.

Un anticuerpo que se fija sobre la P-selectina, no se fija sobre el factor de complemento Clq y tampoco sobrereceptores de Fcγ

sobre células NK, que contiene una parte Fc derivada de un origen humano y se caracterizaporque dicho anticuerpo es un anticuerpo del subgrupo humano IgG4 en donde S228 se sustituye por P y L235 sesustituye por E, inhibiendo la adhesión de células HL60 similares a leucocitos a P-selectina purificada con un valorIC50 de 0,08 a 0,5 μg/ml y por comprender las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de dominio variable de cadena ligeradefinido por la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 3 y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio de cadenavariable pesada definido por la SEQ ID NO: 4.

Anticuerpos anti-P-selectina El invento se refiere a un anticuerpo que se fija sobre la P-selectina, no se fija sobre el factor de complemento Clq y tampoco a receptores de Fcy sobre células NK, que contiene una parte Fc derivada de un origen humano y se caracteriza porque dicho anticuerpo es un anticuerpo del subgrupo humano IgG4 en donde S228 se sustituye por P y L235 se sustituye por E, inhibiendo la adhesión de células HL60 similar a leucocitos a P-selectina purificada con un valor IC50 de 0, 08 a 0, 5 μg/ml y por comprender las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 3 y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio de cadena variable pesada definido por la SEQ ID NO: 4. Esta divulgación se refiere en general a anticuerpos anti-Pselectina y, en particular, a anticuerpos anti-P-selectina que no fijan el factor de complemento C1q. De preferencia, los anticuerpos descritos aquí son anticuerpos humanos o humanizados.

La P-selectina (CD62P, GMP-140, PADGEM, LECAM-3) es una proteína de 140 kDa que depende del calcio y fija hidratos de carbono y que se expresa en las superficies de plaquetas activadas y en el endotelio en respuesta a la trombina y otros agonistas (McEver y col., J. Biol. Chem. 270:11025 (1995) ; Varki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7390 (1994) ; Springer T.A., Annu. Rev. Physiol. 57:827 (1995) ) . En ambos tipos de células, la P-selectina se almacena en gránulos secretorios, es decir, gránulos a de plaquetas y cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales (McEver y col., J. Clin. Invest. 84:92 (1984) ) . Es una glucoproteína transmembrana de tipo I, que se compone de un dominio lectina con grupos NH2 terminales, seguido de un dominio similar al EGF, nueve repeticiones cortas de consenso con homología con las proteínas reguladoras del complemento, un dominio transmembrana y una corta cola citoplásmica (Johnston y col., Cell 56:1033 (1989) ) . La estructura de la P-selectina es similar a la de otros dos representantes del grupo de la selectina, la E- y la L-selectina, que se expresan en células endoteliales activadas por citocina (E-selectina) o se expresan constitutivamente en la mayor parte de grupos de leucocitos (L-selectina) .

Se sabe que todas las selectinas se fijan con poca afinidad sobre los oligosacáridos pequeños sialilados, fucosilados, por ejemplo el sialil-Lewis x (sLex; Foxall y col., J. Cell. Biol. 117:895 (1992) ; Varki, Curr. Opin. Cell. Biol.

257:257 (1992) ) . La P-y la L-selectina, pero no la E-selectina, se fijan también sobre hidratos de carbono sulfatados concretos, por ejemplo el sulfato de heparina (véase una revisión en: McEver y Cummings, J. Clin. Invest. 100:S97 (1997) ) . Los ligandos de gran afinidad con la P-selectina son glucoproteínas similares a la mucina (McEver y col., J. Biol. Chem. 270:11025 (1995) ) , que constan de una estructura de polipéptido con racimos de O-glucanos sialilados. Un ligando sialomucina sobre el que se fija con preferencia la P-selectina es el ligando 1 de glucoproteína de Pselectina (PSGL-1, CD162) , que normalmente se expresa como homodímero con dos subunidades unidas mediante un disulfuro de pesos moleculares relativos aproximadamente de 120 kDa con leucocitos circulantes. El punto de unión de la P-selectina se localiza en la parte del extremo de grupos terminales NH2 del PSGL-1. Mediante la unión a este ligando, la P-selectina interviene en el rodamiento de los leucocitos sobre las plaquetas activadas y células endoteliales. El proceso de rodamiento reduce en gran manera la velocidad de movimiento de los leucocitos, lo cual es un requisito previo para la adhesión firme y posterior transmigración de los leucocitos al subendotelio pero también para la acumulación de leucocitos en los trombos.

Las investigaciones que utilizan ratones deficitarios en P-selectina y anticuerpos que bloquean específicamente la Pselectina han puesto de manifiesto que la P-selectina interviene en la patofisiología de numerosas enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, incluida la lesión por isquemia/reperfusión (Winn y col., J. Clin. Invest. 92:2042 (1993) ; Massberg y col., Blood 92:507 (1998) ) . Además, existe una contribución clara de la P-selectina a las enfermedades cardiovasculares que tienen un componente inflamatorio, por ejemplo la aterosclerosis (Collins y col.,

J. Exp. Med. 191: 189 (2000) ; Johnson y col., J. Clin. Invest. 99:1037 (1997) ) , la restenosis (Manka y col., Circulation 103:1000 (2001) ; Bienvenu y col., Circulation 103:1128 (2001) ) y la trombosis (Kumar y col., Circulation 99:1363 (1999) ; Andre y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13835 (2000) ; Blann y col., Br. J. Haematol. 108:191 (2000) ; Myers y col., Thromb. Haemostasis 85: 423 (2001) . Evidentemente, la inhibición de la función de la P-selectina podría ser eficaz como terapia en varias enfermedades que implican la adherencia de los leucocitos al endotelio vascular o a las plaquetas (véase, p.ej. WO 93/06863, WO 94/25067) .

En el estado de la técnica se han descrito los anticuerpos contra la P-selectina y se han investigado sus efectos antiinflamatorios y antitrombóticos. En la patente US-4.783.399 y el documento WO 93/06863 se describen anticuerpos monoclonales de ratón contra la P-selectina que reaccionan con plaquetas activadas. Geng J. G. y col. (J. Biol. Chem., 266 (1991) 22313-22318) describen anticuerpos monoclonales de ratón que se fijan sobre el fragmento de aminoácidos (aa) de la P-selectina, que es el fragmento aa 60-75 (de Cis a Glu) , realizando el recuento con arreglo a la secuencia Swiss-Prot P16109 que incluye la secuencia de señal. El documento WO 93/21956 se refiere a anticuerpos monoclonales de ratón contra la P-selectina y a anticuerpos humanizados del subgrupo IgG1 que compiten con un anticuerpo definido y se fijan en presencia del fragmento de la P-selectina (aa 60-75) y en ausencia de iones calcio.

La WO 94/25067 describe anticuerpos de anti-P-selectina monoclonales de ratón (anticuerpo de ratón PB 1.3 como se secreta mediante una línea celular designada acceso ATCC Nº HB 1104) y anticuerpos humanizados frente a Pselectina. Ninguno de los anticuerpos monoclonales de ratón mencionados contra la P-selectina humana es útil para el tratamiento de pacientes humanos. Actualmente se halla en fase de desarrollo preclínico un anticuerpo humanizado contra la P-selectina del subgrupo IgG1 humano, mencionado en el documento WO 93/21956 (www.mrctechnology.org) .

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a anticuerpos caracterizados porque dichos anticuerpos fijan la P-selectina y no fija el factor de complemento C1q humano y tampoco el receptor Fcy sobre células NK. Los anticuerpos del invento contienen una parte Fc derivada de origen humano, y se caracterizan porque estos anticuerpos son de la subclase humana IgG4 en donde S228 se sustituye por P y L235 se sustituye por E y por la inhibición de la adhesión de células HL60 leucocitarias a P-selectina purificada con un valor IC50 de 0, 08 a 0, 5 μg/ml y comprendiendo las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera definido por la aminosecuencia SEQ ID nº 3 y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada definido por la SEQ ID nº 4.

Los anticuerpos de la invención contienen una parte Fc derivada de un origen humano. Estos anticuerpos son con preferencia anticuerpos humanizados o humanos. Los anticuerpos tienen propiedades nuevas y susceptibles de invención, que producen un beneficio a un paciente que sufra trastornos inflamatorios y trombóticos, que sufra en especial la enfermedad oclusiva de arterias periféricas (PAOD) y la isquemia crítica de extremidades (CLI) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

En la figura 1 se muestra que los anticuerpos de la invención inhiben la adhesión de las células HL60, similares a los leucocitos, sobre placas de microvaloración recubiertas con P-selectina purificada. Los anticuerpos mutados son mas potentes que el anticuerpo “original”, no mutado.

En la figura 2 se representa la actividad inhibidora de los anticuerpos de la invención en los ensayos de roseteado para medir la adhesión de plaquetas activadas con trombina sobre las células HL60.

En las figuras 3a y 3b se representa la actividad cruzada de los anticuerpos de la invención con la P-selectina de rata y cinomóloga. Según la figura 3a, los anticuerpos anti-P-selectina no afectan la adhesión de las plaquetas de rata activadas con trombina sobre las células HL60, mientras que los anticuerpos anti-P-selectina policlonales disponibles comercialmente (Pharmingen 09361A) inhiben esta interacción. Según la figura 3b, los anticuerpos de la invención inhiben la adhesión de las plaquetas cinomólogas activadas... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo que se fija sobre la P-selectina, no se fija sobre el factor de complemento Clq y tampoco sobre receptores de Fcy sobre células NK, que contiene una parte Fc derivada de un origen humano y se caracteriza porque dicho anticuerpo es un anticuerpo del subgrupo humano IgG4 en donde S228 se sustituye por P y L235 se sustituye por E, inhibiendo la adhesión de células HL60 similares a leucocitos a P-selectina purificada con un valor IC50 de 0, 08 a 0, 5 μg/ml y por comprender las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 3 y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio de cadena variable pesada definido por la SEQ ID NO: 4.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo humano o humanizado.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, que comprende el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 y el dominio variable de cadena pesada definido por la SEQ ID NO 4.

4. El anticuerpo de cualqujiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la región constante de cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 y la región constante de cadena ligera K es como se define en la SEQ ID NO: 23.

5. Molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.

7. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6.

8. Un método para la preparación de una molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 7 bajo condiciones que permitan la sintesis de dicha molécula de anticuerpo y recuperar dicha molécula de anticuerpo de dicho cultivo.

9. Un anticuerpo que se fija a la P-selectina, no fijándose al factor de complemento C1q y tampoco a los receptores Fcy sobre células NK, conteniendo una parte Fc derivada de origen humano, en donde el anticuerpo es obtenible por la células huésped de la reivindicación 7.

10. Una composición que comprende una molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9.

11. La composición de la reivindicación 10, que es una composición farmacéutica o de diagnóstico.

12. Una composición farmacéutica que comrpende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9 y por o menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaicones 1 a 4 o 9 para uso en la profilaxis o tratamiento de trastornos inflamatorios y trombóticos.

14. El anticuerpo de cualqueira de las reivindicaciones 1 a 4 o 9 para uso en la profilaxis o tratamiento de trastornos inflamatorios y trombóticos de conformidad con la reivindiación 13, en donde dicho trastorno es enfermedad oclusiva arterial periférica (PAOD) o isquemia crítica de las extremidades (CLI) .

15. Un kit que comprende una molécula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 9, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, un vector de la reivindicación 6 o una célula huésped de la reivindicación 7.