Vectores recombinantes basados en el virus vaccinia modificado deAnkara (MVA) como vacunas contra la leishmaniasis.

Los vectoresde la invención contienen secuencias codificantes de la proteínaLACK, preferentemente insertadas en el locus de hemaglutinina delvirus y bajo el control de un promotor que permite su expresióna lo largo del ciclo de infección del virus. Son vectores seguros, estables, que dan lugar a una potente respuesta inmune que confiere protección frente a la leishmaniasis, por lo que son buenoscandidatos para ser utilizados en vacunación frente a esta enfermedad, especialmente en seres humanos, así como en el reservorio animal más importante de esta antropozoonosis, los perros..

Vectores recombinantes basados en el virus Vaccinia modificado de Ankara (MVA) como vacunas contra la leishmaniasis Campo de la invención La presente invención se refiere a virus recombinantes basados en el virus vaccinia modificado de Ankara (MVA) . Más concretamente, la invención se refiere a virus recombinantes derivados del MVA que actúan como sistemas de expresión de la proteína LACK o de fragmentos inmunogénicos de la misma y a su uso en la vacunación frente a la leishmaniasis tanto de seres humanos como de otros mamíferos afectados, como los perros.

Estado de la Técnica La leishmaniasis es una antropozoonosis que abarca un complejo grupo de cuadros clínicos producidos por protozoos del género Leishmania, los cuales parasitan células del sistema monocito-macrófago. Leishmania es un protozoo flagelado que pertenece al orden Kinetoplastida y a la familia Tr y panosomatidae. La clasificación del género Leishmania en sus diferentes especies es compleja y en la actualidad se realiza mediante el análisis de los fragmentos de restricción del ADN del Kinetoplasto. Es la siguiente:

ORDEN: Kinetoplastida FAMILIA: Tr y panosomatidaeGÉNERO: Leishmania SUBGÉNERO: Leishmania Complejo: L. donovani L. donovani; L. infantum; L. chagasi; L. archibaldi Especies fuera del complejo L. donovani L. tropica; L. aethiopica; L. major; L. gerbilli Complejo: L. mexicana L. mexicana; L. amazonensis; L. venezuelensis; L. aristidesi SUBGÉNERO: Viannia Complejo: L. braziliensis L. braziliensis; L. panamensis; L. guyanensis; L. peruviana El ciclo vital se desarrolla en dos huéspedes, uno vertebrado (mamífero) y un vector invertebrado (mosquito hembra de la familia Phlebotomidae, un díptero del género Phlebotomus en el Viejo Mundo y Lutzomya en el Nuevo Mundo también conocido como beatilla de las arenas) . En el huésped vertebrado, Leishmania es un parásito intracelular obligado que se encuentra en los macrófagos en forma de amastigote. Los amastigotes son formas redondeadas con unas dimensiones de 3-5 μm x 2-3 μm, con flagelos rudimentarios que no sobresalen del soma y que se reproducen por fisión binaria. Los amastigotes pasan al insecto, con la picadura al ingerir sangre de un mamífero parasitado. En la bolsa peritrófica del intestino medio del insecto, los amastigotes se transforman en promastigotes, forma móvil y alargada con un único flagelo en su polo anterior, que se multiplican activamente en el intestino medio del mosquito. Al cabo de 15-20 días de su ingestión comienzan a desprenderse de las cutículas intestinales invadiendo la hipofaringe. Por la picadura a un nuevo huésped, el insecto inocula los promastigotes, denominados metacíclicos, quienes una vez en el interior del huésped vertebrado serán fagocitados por las células del sistema monocito-macrófago, donde se transformarán y multiplicarán como amastigotes.

Las manifestaciones clínicas de la enfermedad varían dependiendo de la respuesta inmune del hospedador, la cepa y la virulencia del parásito, observándose desde lesiones cutáneas que curan espontáneamente, hasta una forma visceral de la enfermedad que puede conducir a la muerte en caso de no recibir tratamiento.

La leishmaniasis cutánea, típicamente, es causada por Leishmania tropica, Leishmania major y Leishmania aethiopica (especies del "Viejo Mundo") y por Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania panamensis, Leishmania guyanensis, Leishmania peruviana, Leishmania chagasi y otras especies en el Nuevo Mundo. Se presenta, con frecuencia, en forma de úlceras superficiales con bordes elevados, que surgen por lo común en zonas localizadas o expuestas de la cara y las extremidades y que pueden acompañarse de lesiones cutáneas y adenopatía regional. Las manifestaciones clínicas de la leishmaniasis cutánea en el Viejo y en el Nuevo Mundo son similares. Se necesita que transcurran años para la resolución espontánea de las lesiones y suele quedar una cicatriz plana atrófica.

La leishmaniasis visceral, conocida también como Kala-azar o fiebre Dum-Dum, es causada por las especies L. donovani, L. chagasi y L. infantum. Su sintomatología característica en humanos consiste en cefaleas, fiebre a

intervalos, astenia, diarrea, dolores abdominales, cólicos, adenopatías, hepatomegalia, esplenomegalia, anemia, leucopenia, trombocitopenia, lesiones oculares, crecimiento excesivo de uñas y pestañas así como la aparición de infecciones oportunistas. En España y Sudoeste de Europa la leishmaniasis es una zoonosis, siendo los perros su reservorio principal. Estudios epidemiológicos revelan que hasta el 80% de los perros en zonas endémicas están infectados (3, 31) , de los cuales el 50% desarrolla la forma visceral de la enfermedad (3, 17) .

La especie tradicionalmente conocida como causante de la leishmaniasis visceral en la zona mediterránea es Leishmania infantum. Sin embargo, su distribución se extiende hacia el este de Europa y países asiáticos. En la actualidad se considera como sinónimo de Leishmania chagasi (22) , por lo que su distribución se ampliaría hasta América latina y posiblemente hasta la zona sur de Estados Unidos (10) .

La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que la prevalencia mundial de la enfermedad en humanos alcanza los 12 millones de personas, con una incidencia anual de 1, 5 a 2 millones de nuevos casos de leishmaniasis cutánea y 500000 nuevos casos de leishmaniasis visceral (WHO 2000) . Existe además una elevada incidencia de la enfermedad en pacientes de SIDA, ya que la infección con HIV incrementa el riesgo de desarrollar leishmaniasis de 100 a 1000 veces (21) , lo que provoca una elevada mortalidad. La OMS estima que entre el 2 y el 9% de todos los pacientes de SIDA en la zona sur de Europa desarrollarán leishmaniasis visceral (WHO 1995) . Aunque existen fármacos que pueden utilizarse para tratar la enfermedad, las variantes del parásito en casos de leishmaniasis visceral y cutánea que son resistentes a esos fármacos son cada vez más comunes, por lo que es importante el desarrollo de estrategias alternativas para la lucha contra esta enfermedad como puedan ser el desarrollo de vacunas. El hecho de que pacientes que se han recuperado de una infección natural desarrollan una fuerte respuesta inmune frente a Leishmania sugiere la posibilidad del desarrollo de una vacuna contra este complejo parásito (19) .

Diferentes antígenos han sido utilizados, confiriendo distintos grados de protección. Un estudio reciente en el que se comparan diferentes candidatos en forma de ADN ha demostrado que el gen de la proteína LACK es el más prometedor (1) . El antígeno LACK (Leishmania homolog for receptors for Activated C Kinase) es una proteína de 36 KDa de peso molecular, altamente conservada entre las diferentes especies de Leishmania, y que se expresa tanto en el promastigote como en el amastigote. La proteína LACK es una diana preferencial de la respuesta temprana anti-parasitaria, de forma que dirige la expansión de células secretoras de IL-4 que conducen a la enfermedad. Los estudios indican que la administración de vectores de ADN desnudo que codifican el antígeno LACK es capaz de proporcionar protección frente a L. major aunque, a pesar de su alta inmunogenicidad, no logran proteger frente a la leishmaniasis visceral (VL) murina cuando son inoculados por vía intradérmica o intravenosa (36) , lo que podría interpretarse como indicación de que LACK podría no ser un antígeno útil para vacuna general contra la leishmaniasis basada en vectores de ADN desnudo.

Sin embargo, el sistema utilizado para hacer llegar la secuencia codificante del antígeno y la posibilidad de la presencia de éste en la célula puede ser un elemento crítico que determina la eficacia antigénica, por lo que LACK puede ser un antígeno útil cuando su presencia en la célula viene determinada por la inclusión de su secuencia codificante en un vector que posibilite su expresión que no sea ADN desnudo. Los vectores basados en virus Vaccinia han demostrado ser un buen sistema de aporte de antígenos para el control de enfermedades infecciosas en estudios con modelos animales (37) y, en particular, han demostrado gran capacidad para aumentar la respuesta inmune celular específica cuando a los animales se les administra una primera dosis de inmunización (priming) que contiene diversos vectores recombinantes (ej. ADN desnudo, proteínas, seudopartículas, vectores virales distintos al virus vaccinia) seguida posteriormente de una segunda dosis de refuerzo (booster) con un Virus Vaccinia recombinante, expresando los vectores de la primera y de la segunda dosis el mismo antígeno (18, 35)... [Seguir leyendo]

1. Un vector recombinante del virus MVA que comprende una secuencia codificante de la proteína LACK, caracterizado porque la secuencia codificante de la proteína LACK está contenida en un fragmento de ADN que está

insertado en el locus de hemaglutinina del genoma de MVA entre las regiones flanqueantes derecha e izquierda del gen de la hemaglutinina (HA) , fragmento de ADN en el cual hay un promotor sintético temprano/tardío pE/L que está unido a la secuencia codificante de la proteína LACK de forma que el promotor dirige la expresión de dicha secuencia codificante para dar lugar a la proteína LACK.

2. Un vector recombinante del virus MVA según la reivindicación 1, en el que la secuencia codificante de la proteína LACK es la de la especie Leishmania infantum.

3. Un vector recombinante del virus MVA según la reivindicación 2, en el que la secuencia codificante de la proteína LACK da lugar a la expresión de una forma de la proteína LACK que contiene la totalidad de sus 15 aminoácidos.

4. Un vector recombinante del virus MVA según la reivindicación 1, que comprende la secuencia codificante de la proteína LACK de Leishmania infantum, caracterizado porque la secuencia codificante de la proteína LACK está contenida en un fragmento de ADN que está insertado en el locus de hemaglutinina del genoma de MVA entre 20 las regiones flanqueantes derecha e izquierda del gen de la hemaglutinina (HA) , fragmento de ADN en el cual hay dos promotores de Vaccinia colocados en dirección opuesta y localizados en una parte del fragmento de ADN alejada de sus extremos, promotores que son un promotor de Vaccinia p7.5 al que está unido un gen de #-gal de forma que el promotor p7.5 dirige su expresión, y el promotor sintético temprano/tardío pE/L al que está unida la secuencia codificante de la proteína LACK de forma que el promotor dirige la expresión de dicha secuencia codificante para dar lugar a la proteína LACK.

5. Una composición que comprende un vector recombinante del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y, opcionalmente, al menos un adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Una composición según la reivindicación 5, en la que está presente la proteína CD40L.

7. Uso de un vector recombinante del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medicamento destinado a ser administrado a un mamífero susceptible de ser infectado por una especie del género Leishmania, para la prevención o el tratamiento en dicho mamífero de una enfermedad causada por una especie del género Leishmania.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad se corresponde con la leishmaniasis visceral.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la leishmaniasis visceral está causada por Leishmania infantum. 40

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el mamífero susceptible de ser infectado por dicha especie del género Leishmania al que está destinado el medicamento es un ser humano.

11. Uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad se corresponde con la leishmaniasis cutánea. 45

12. Uso según la reivindicación 11, en que la leishmaniasis cutánea está causada por Leishmania major.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que el mamífero susceptible de ser infectado por dicha especie del

género Leishmania al que está destinado el medicamento es un ser humano. 50

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que el medicamento está destinado a ser administrado en una única dosis de vacunación.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en el que el medicamento está destinado a ser

55 administrado en al menos una de las dosis de vacunación que constituyen un protocolo de vacunación constituido por al menos dos dosis de vacunación, cada una de las cuales se administra espaciadas en el tiempo.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que el medicamento está destinado a ser administrado tanto en la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune como en al menos una de las dosis de 60 vacunación posteriores a la primera.

17. Uso según la reivindicación 15, en el que el medicamento está destinado a ser administrado solamente en la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune, estando ausente de las dosis de vacunación posteriores a la primera.

65 18. Uso según la reivindicación 17, en el que el medicamento está destinado a ser administrado solamente en la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune, conteniendo al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera de las que está ausente el medicamento un vector recombinante diferente que es también un sistema de expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma.

19. Uso según la reivindicación 15, en el que el medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera, estando ausente de la primera dosis de vacunación.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que el medicamento está destinado a ser administrado en al menos

una de las dosis de vacunación posteriores a la primera, conteniendo la primera dosis de vacunación de la que está ausente el medicamento un vector recombinante diferente que es también un sistema de expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que el medicamento está destinado a ser administrado en al menos una de las dosis de vacunación posteriores a la primera, conteniendo la primera dosis de vacunación de la que está ausente el medicamento un ADN desnudo que es también un sistema de expresión de la proteína LACK o de un fragmento inmunogénico de la misma.

22. Uso según la reivindicación 7, en el que el mamífero susceptible de ser infectado por una especie del 20 género Leishmania al que está destinado el medicamento es un perro.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que la leishmaniasis está causada por Leishmania infantum.

Figura 1

TK-L TK-R HA-1 HA-2

HA-MVA

2: MVA-LACK

3: VV-LACK TK-

Figura 2

Anti-LACK Anti-WR

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

LACK

• PEPT-II

Figura 10b

Figura 11

A

Figura 12

Figura 13

Figura 14

AD

DNA_LACK / MVA_LACK 1 107 DNA CTRL / VV_LUC 5 107

BE

DNA_LACK / MVA_LACK 5 107 N

C

-

-

++

DNA_LACK / VV_LACK 5 107Figura 15

Figura 16

A

B

Figura 18

Figura 19

A

B

Figura 20