Uso de antagonistas de hedgehog cinasa para inhibir la señalización de hedgehog y para tratar cáncer.

El uso de un antagonista de hedgehog cinasa CSNK1A1, GYK o PRKRA para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular,

un tumor en un mamífero y/o cáncer, en el que el antagonista de hedgehog cinasa CSNK1A1, GYK o PRKRA es una molécula de ARNi.

Uso de antagonistas de hedgehog cinasa para inhibir la señalización de hedgehog y para tratar cáncer CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al nuevo uso de las cinasas hedgehog CDC2L1, CSNK1A1, GYK, NEK1, PLK1, PRKAR1A, PRKRA, TTBK2, TTK y antagonistas contra ellas para regular la señalización de hedgehog, y a su uso terapéutico en diversas patologías o trastornos fisiológicos que están mediados, en parte, por o que resultan de ellas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los miembros de la familia hedgehog de moléculas señalizadoras median muchos procesos de formación del patrón de corto y largo alcance durante el desarrollo embrionario, fetal y de adulto de los invertebrados y de los vertebrados. En drosophila melanogaster, un único gen hedgehog regula la formación del patrón de los discos segmentales e imaginales. Por el contrario, en vertebrados, una familia de genes hedgehog está implicada en el control de la proliferación, diferenciación, migración y supervivencia de células y tejidos derivados de las tres capas germinales, incluyendo, por ejemplo, asimetría izquierda-derecha, desarrollo del SNC, formación del patrón de somitos y extremidades, condrogénesis, esqueletogénesis y espermogénesis.

La familia de genes hedgehog de vertebrados incluye al menos cuatro miembros o parálogos del único gen hedgehog de drosophila (documentos WO 95/18856 y WO 96/17924) . Tres de estos miembros, conocidos como Desert hedgehog (Dhh) , Sonic hedgehog (Shh) e Indian hedgehog (Ihh) , existen aparentemente en todos los vertebrados, incluyendo peces, pájaros y mamíferos. Dhh se expresa principalmente en los testículos, tanto en el desarrollo embrionario del ratón como en el roedor y ser humano adultos; Ihh está implicado en el desarrollo óseo durante la embriogénesis, y en la formación ósea en el adulto; y Shh está implicado en múltiples tipos celulares embrionarios y adultos derivados de los tres linajes. Shh se expresa en niveles elevados en el notocordio y placa ventral mesencefálica de embriones de vertebrados en desarrollo, y dirige el destino celular en la extremidad en desarrollo, somitos y tubo neural. Los ensayos con explantes in vitro, así como la expresión ectópica de Shh en animales transgénicos, muestran que Shh desempeña un papel clave en la formación del patrón del tubo neural, Echelard et al., (1993) , Cell 75: 1417-30 (1993) ; Ericson et al., Cell 81: 747-56 (1995) ; Marti et al., Nature 375: 32225 (1995) ; Hynes et al., Neuron 19: 15-26 (1997) .

La señalización de hedgehog también desempeña un papel en el desarrollo de extremidades (Krauss et al., Cell 75: 1431-44 (1993) ; Laufer et al., Cell 79: 1165-73 (1994) ; somitos (Fan y Tessier-Lavigne, Cell 79: 1175-86 (1994) ; Johnson et al., Cell 79: 1165-73 (1994) , pulmones (Bellusci et al., Devel. 124: 53-63 (1997) y piel (Oro et al., Science 276: 817-21 (1997) . Igualmente Ihh y Dhh están implicados en el desarrollo de hueso, intestino y células germinales (Apelqvist et al., Curr. Biol. 7: 801-804 (1997) ; Bellusci et al., Dev. Supl. 124: 53-63 (1997) ; Bitgood et al., Curr. Biol.

6: 298-304 (1996) ; Roberts et al., Development 121: 3163-74 (1995) . Específicamente, Ihh se ha visto implicado en el desarrollo de condrocitos (Vortkamp et al., Science 273: 613-22 (1996) ) , mientras que Dhh desempeña un papel clave en el desarrollo de los testículos.

La señalización de hedgehog se produce a través de la interacción de la proteína hedgehog (por ejemplo, en mamíferos, Shh, Dhh, Ihh, colectivamente "Hh") con el receptor de hedgehog, Patched (Ptch) , y el correceptor Smoothened (Smo) . Hay dos homólogos de mamíferos de Ptch, Ptch-1 y Ptch-2 (colectivamente "Ptch") , los cuales son proteínas transmembránicas que cruzan 12 veces un dominio detector de esterol (Motoyama et al., Nature Genetics 18: 104-106 (1998) , Carpenter et al., P.N.A.S. (U.S.A.) 95 (23) : 13630-40 (1998) . La interacción de Hh con Ptch dispara una cascada de señalización que da como resultado la regulación de la transcripción por factores de transcripción de dedos de cinc de la familia Gli.

La unión de Hh a Ptch libera Smoothened (Smo) , una proteína transmembránica que cruza 7 veces la membrana, acoplada a proteínas G, para activar entonces una ruta de transducción de señales intracelular intrincada. La activación de Smo conduce entonces a la señalización a través de un complejo multimolecular, incluyendo Costal2 (Cos2) , Fused (Fu) y supresor de Fused (Su (Fu) ) , dando como resultado un transporte nuclear del factor de transcripción Gli. Ho et al., Curr. Opin. Neurobiol. 12: 57-63 (2002) ; Nybakken et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 503511 (2002) ; i Altaba et al., Nat. Rev. Neurosci. 3: 24-33 (2002) . En vertebrados hay tres factores de transcripción Gli conocidos: Gli1, Gli2 y Gli3. Mientras que Gli1 es un activador transcripcional que es inducido universalmente en células sensibles a Hh, Gli2 y Gli3 pueden actuar como activadores o represores de la transcripción, dependiendo del contexto celular. En ausencia de señalización de Hh, Gli3 es procesada a un represor transcripcional nuclear más pequeño, que carece del dominio carboxi-terminal de Gli de longitud completa. Con la activación de Smo, se evita la escisión de la proteína Gli3, y se genera la forma de longitud completa con función de activación de la transcripción. Gli2 también codifica una función represora en su forma carboxi-terminalmente truncada, pero su formación no parece estar regulada por la señalización de Hh. Stecca et al., J. Biol. 1 (2) :9 (2002) .

Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa importante de muerte en los Estados Unidos de América,

tras la cardiopatía (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993) ) . El cáncer se caracteriza por el incremento en el número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal, que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que eventualmente se extienden vía la sangre o el sistema linfático a ganglios linfáticos regionales y a sitios distantes vía un proceso denominado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera en condiciones en las que no crecerían las células normales. El cáncer se manifiesta por sí mismo en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y agresividad.

Se ha implicado a la señalización de hedgehog en una amplia variedad de cánceres y carcinogénesis. Un ejemplo del proceso carcinogénico es la vascularización. La angiogénesis, el proceso de hacer brotar nuevos vasos 10 sanguíneos a partir de la vasculatura existente, y la arteriogénesis, la remodelación de pequeños vasos en vasos de conductos más grandes, son ambos aspectos fisiológicamente importantes del crecimiento vascular en tejidos adultos (Klagsbrun y D'Amore, Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39 (1991) ; Folkman y Shing, J. Biol. Chem. 267 (16) : 10931-4 (1992) ; Beck y D'Amore, FASEB J. 11 (5) : 365-73 (1997) ; Yancopoulos et al., Cell 93 (5) : 661-4 (1998) ; Buschman y Scaper, J. Pathol. 190 (3) : 338-42 (2000) ) . Estos procesos de crecimiento vascular también son 15 necesarios para procesos beneficiosos tales como reparación tisular, curación de heridas, recuperación de isquemia tisular y ciclo menstrual. Sin embargo, también son necesarios para el desarrollo de afecciones patológicas tales como el crecimiento de neoplasias, retinopatía diabética, artritis reumatoide, psoriasis, ciertas formas de degeneración macular, y ciertas patologías inflamatorias (Cherrington et al., Adv. Cancer Res. 79:1-38 (2000) ) . De este modo, la inhibición del crecimiento vascular puede inhibir la proliferación, crecimiento, diferenciación y/o supervivencia celular. Puesto que se ha demostrado que Hh promueve la angiogénesis, sería de esperar que los antagonistas de Hh poseyeran propiedades antiangiogénicas.

Las cinasas son componentes importantes de la mayoría de las rutas de señalización biológicas, y la ruta de señalización de hedgehog no es una excepción. Se han identificado aquí ciertas cinasas necesarias para la señalización de hedgehog efectiva. Como resultado, sería de esperar que las moléculas que modulan estas cinasas modulen la señalización de hedgehog, así como traten diversas afecciones y/o trastornos en los que la señalización de hedgehog es un factor determinante.

El documento WO 2004/054657 describe oligonucleótidos antisentido que están dirigidos contra PLK1.

El documento WO 03/000873... [Seguir leyendo]

1. El uso de un antagonista de hedgehog cinasa CSNK1A1, GYK o PRKRA para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno proliferativo celular, un tumor en un mamífero y/o cáncer, en el que el antagonista de hedgehog cinasa CSNK1A1, GYK o PRKRA es una molécula de ARNi.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que antagonista de hedgehog cinasa es el antagonista de hedgehog cinasa GYK.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que antagonista de hedgehog cinasa es el antagonista de hedgehog cinasa PRKRA.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de CSNK1A1, GYK o PRKRA, que es inhibido por el antagonista de CSNK1A1, GYK o PRKRA, respectivamente, comprende la secuencia de la Figura 1B, 1C o 1G, respectivamente.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que el antagonista de hedgehog cinasa CSNK1A1, GYK o PRKRA, se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento o a un agente citotóxico.

6. Un método in vitro para diagnosticar la presencia de un trastorno proliferativo celular, que comprende comparar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido de hedgehog cinasa CSNK1A1, GYK o PRKRA: (a) en una muestra de ensayo de tejido o células obtenida de dicho mamífero, y (b) en una muestra de control de tejido o células no cancerosas normales del mismo origen o tipo tisular; en el que un mayor nivel de expresión del polipéptido de CSNK1A1, GYK o PRKRA en la muestra de ensayo, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de un trastorno proliferativo celular en el mamífero del que se obtiene la muestra de ensayo.

7. Un método in vitro para modular la proliferación, diferenciación o supervivencia de células madre no comprometidas en cultivo, que comprende poner en contacto tales células con una cantidad efectiva de un antagonista de hedgehog cinasa CSNK1A1, GYK o PRKRA.

8. El uso de la reivindicación 5, en el que el agente inhibidor del crecimiento o agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste en: un maitansinoide, una calecheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica.

Proteína CDC2L1 de ratón:

Proteína CSNK1a1 de ratón:

Proteína GYK de ratón: Proteína NEK1 de ratón:

Proteína PLK1 de ratón:

Proteína PRKAR1A de ratón: Proteína PRKRA de ratón:

Proteína TTBK2 de ratón:

Proteína TTK de ratón: ADN de CDC2L1 de ratón: ADN de CSNK1A1 de ratón:

ADN de GYK de ratón: ADN de NEK1 de ratón: ADN de PLK1 de ratón: ADN de PRKAR1A de ratón:

ADN de PRKRA de ratón: ADN de TTBK2 de ratón: ADN de TTK de ratón: Proteína de CDC2L1 humana:

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Proteína de PRKRA humana:

Proteína de TTBK2 humana: Proteína de TTK humana: ADN de CDC2L1 humana: Secuencia de ADN de CSNK1A1 humana:

ADN de GYK humana: ADN de NEK1 humana: ADN de PLK1 humana: ADN de PRKAR1A de ratón:

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