Procedimiento para la preparación de una genoteca de ácido nucleico.

Un procedimiento para preparar una genoteca de ácido nucleico que comprende una pluralidad de elementos,

por lo que cada elemento de dicha genoteca de ácido nucleico comprende una primera extensión de nucleótidos, una segunda extensión de nucleótidos y una tercera extensión de nucleótidos, por lo que la secuencia de la primera extensión de nucleótidos y de la tercera extensión de nucleótidos son idénticas en cada elemento 5 de la genoteca de ácido nucleico y los elementos de la genoteca de ácido nucleico difieren en la secuencia de la segunda extensión de nucleótidos, por lo que el procedimiento comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar un primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria que tiene un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de la primera o tercera extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico, por lo que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento,

b) proporcionar una primera genoteca de oligonucleótidos que comprende varios miembros, por lo que cada miembro es un segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria, por lo que el segundo oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario o parte del mismo es el mismo para los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos y por lo que dicho saliente monocatenario es esencialmente complementario al saliente monocatenario del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, por lo que la estructura bicatenaria comprende una extensión de nucleótidos, por lo que los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos difieren en la secuencia de dicha extensión de nucleótidos y la secuencia de dicha extensión de nucleótidos de los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos corresponde a la secuencia, o parte de la misma, de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico,

c) combinar el primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y la primera genoteca de oligonucleótidos y ligar una molécula del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario con una molécula de cada miembro de la primera genoteca de oligonucleótidos mediante sus salientes monocatenarios, después de lo cual se forma un producto de primera ligación,

d) cortar el producto de primera ligación con dicha segunda enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del miembro de la primera genoteca de oligonucleótidos, por lo que dicha escisión proporciona una pluralidad de primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados,

e) eliminar los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados,

f) proporcionar una segunda genoteca de oligonucleótidos que comprende varios miembros, por lo que cada miembro es un tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria, por lo que el tercer oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una tercera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento y un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario o parte del mismo es diferente para los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos, y por lo que dichos salientes monocatenarios o parte de los mismos del tercer oligonucleótido son esencialmente complementarios a los salientes monocatenarios de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados, y por lo que los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos comprenden una extensión de oligonucleótidos en la estructura bicatenaria que es idéntica en todos los miembros y corresponde a la secuencia, o parte de la misma, de la tercera o primera extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico,

g) combinar la pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y la segunda genoteca de oligonucleótidos y ligar cada molécula de la pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados con una molécula de cada uno de los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos, por lo que el saliente monocatenario del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado es esencialmente complementario al saliente del tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, después de lo cual se forma un producto de segunda ligación,

h) cortar el producto de segunda ligación con la tercera de enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico de los terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios, proporcionando una pluralidad de segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, i) eliminar los terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados,

j) proporcionar un cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria que tiene un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria al saliente monocatenario del segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado, por lo que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una cuarta enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento,

k) combinar el cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y la pluralidad de los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y ligar una molécula del cuarto oligonucleótido y cada molécula de la pluralidad de los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados formando un producto de tercera ligación;

l) cortar el producto de tercera ligación con la cuarta enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del cuarto oligonucleótido u oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios, proporcionando una pluralidad de terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado, y

m) eliminar el cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado.

Procedimiento para la preparación de una genoteca de ácido nucleico La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar una genoteca de ácido nucleico, que comprende una pluralidad de elementos y una genoteca de ácido nucleico obtenible de este modo.

La generación de novo de moléculas de ácido nucleico se está usando cada vez más en la investigación biofarmacéutica para sustituir los procedimientos de clonación, a menudo bastante complejos, necesarios para producir construcciones de ADN deseadas con propiedades optimizadas, por ejemplo, un alto nivel de expresión de proteína en sistemas in vivo o in vitro adecuados. Existen una diversidad de procedimientos conocidos para sintetizar dichas moléculas de ADN. Prácticamente, todos estos procedimientos dependen de la síntesis, apareamiento y posterior ligación de oligonucleótidos monocatenarios sintéticos para ensamblar moléculas de ADN bicatenario de mayor tamaño, que consisten típicamente en de más de cien a varios miles de pares de bases. Sin embargo, la eficacia de estos procedimientos está limitada por varios factores: (i) la calidad de los oligonucleótidos usados, (ii) el tamaño de la construcción deseada y (iii) la proporción de secuencias "difíciles", por ejemplo, aquellas con regiones auto-complementarias, alto contenido de GC, tétradas de G, pliegues de ADN o bloques de secuencia repetitiva. Los propios componentes básicos de oligonucleótidos están contaminados con diversos productos de terminación y deleciones internas. Son especialmente problemáticos los productos n-1 (oligonucleótidos que contienen deleciones internas de un nucleótido que se producen como resultado de reacciones de protección terminal incompletas) , que difícilmente pueden separarse del oligonucleótido de longitud completa deseado. Como muchos oligonucleótidos tienen que ensamblarse para generar un gen completo, la probabilidad de obtener un clon sin errores, es decir, que no incorpore ni siquiera un oligonucleótido defectuoso con un cambio de base o una deleción interna, se aproxima al 0%. Por ejemplo, si un gen se ensamblase a partir de cincuenta oligonucleótidos teniendo cada uno una pureza del 90%, la probabilidad de crear un producto sin errores sería de aproximadamente 0, 950 = 0, 005. Generalmente, deben emplearse procedimientos de corrección de errores pesados para obtener una construcción sin errores del 100%. En muchos casos, los productos de síntesis defectuosos no pueden tolerarse porque errores en la secuencia codificante pueden causar la generación de productos de transcripción o traducción acortados debido, por ejemplo, a un desplazamiento de la fase de lectura abierta. Mientras que los primeros dos problemas pueden aliviarse mediante el uso de oligonucleótidos de muy alta pureza, la formación de estructuras secundarias no deseadas que pueden causar deleciones en el producto de síntesis puede en muchos casos suprimirse únicamente si se permiten alteraciones en la secuencia de ADN.

En la técnica anterior se conocen una diversidad de procedimientos para producir ADN sintético. Casi 30 años atrás, el trabajo pionero de Khorana y colaboradores (Sekiya T, Brown EL, Belagaje R, Fritz HJ, Gait MJ, Lees RG, Ryan MJ, Khorana HG, Norris KE. (1979) , J Biol Chem. 254 (13) : 5781-6, y 5787-801) demostró la síntesis de novo completa de un gen de ARNt supresor por ligación de parejas de oligonucleótidos apareados. En este procedimiento y procedimientos relacionados, oligonucleótidos monocatenarios complementarios que comprenden la secuencia de ADN deseada completa se aparean en parejas para dar fragmentos bicatenarios, que se alinean en el orden correcto en virtud de salientes monocatenarios complementarios (Stabinsky, Patente de Estados Unidos 4.652.639) . Los fragmentos resultantes se ligan después de forma secuencial o en una reacción de un tubo (Jayaraman, Patente de Estados Unidos 5.132.215) enzimática o químicamente. Después de la purificación y/o clonación estos fragmentos génicos pueden unirse entre sí para formar construcciones de ADN de mayor tamaño. En la denominada "síntesis de casete", cada pareja de oligonucleótidos apareados se clona por separado en un vector plasmídico antes de unir los fragmentos usando endonucleasas de restricción (Richards y col., Patente de Estados Unidos 5.093.251) .

Como alternativa, pueden ensamblarse construcciones de ADN a partir de oligonucleótidos parcialmente apareados, que después de la hibridación contienen huecos monocatenarios que deben rellenarse por ADN polimerasas; este procedimiento se denomina comúnmente procedimiento de "rellenado de huecos". De acuerdo con este procedimiento, una diversidad de oligonucleótidos parcialmente solapantes se sintetizan, se purifican y posteriormente se hibridan, habitualmente en parejas o en subgrupos. Después de la síntesis de las cadenas opuestas respectivas usando una ADN polimerasa, los fragmentos individuales se ligan entre sí. Los productos de ligación bicatenarios generados de esta forma pueden clonarse como fragmentos parciales o amplificarse en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos terminales. Sin embargo, este procedimiento está plagado de frecuentes acontecimientos de cebado erróneo y deleciones internas debido a la formación de estructuras secundarias.

Ambos procedimientos son de un uso limitado ya que al aumentar la longitud de la molécula de ácido nucleico a sintetizar aumenta la probabilidad de que uno o varios oligonucleótidos con una secuencia incorrecta se incorporen en el producto final. Dichos errores se copian después en la reacción de ADN polimerasa. Además, también pueden introducirse errores de secuencia durante la reacción de PCR.

Se describe una combinación de los procedimientos anteriores en la Patente de Estados Unidos 6.472.184, en la que una serie de oligonucleótidos enlazables que representan regiones contiguas en una cadena de la secuencia diana se hibridan con oligonucleótidos no enlazables que son complementarios a los extremos 3' o 5' de los oligonucleótidos enlazables que se van a conectar. Este procedimiento es relativamente simple y sencillo pero también está plagado de los problemas comunes compartidos por todos los procedimientos que usan oligonucleótidos monocatenarios como componentes básicos: la formación de estructuras secundarias no deseadas y la incorporación de oligonucleótidos n-x, conduciendo ambas a deleciones internas.

Aparte de estos procedimientos convencionales, existen procedimientos adicionales conocidos en la técnica para la producción de moléculas de ADN sintéticas. La Solicitud de Patente Internacional WO 98/15567 y la Patente de Estados Unidos 6.110.668 muestran un procedimiento dirigido por molde de acoplamiento de oligonucleótidos para dar construcciones de ADN sintéticas por ligación de una pluralidad de oligonucleótidos que son al menos parcialmente complementarios al ADN de molde monocatenario, y los extremos de dichos oligonucleótidos se ligan en el orden correcto en etapas de apareamiento y desnaturalización sucesivas. Sin embargo, una condición previa para la aplicación de este procedimiento es la existencia previa de un ADN de molde adecuado, excluyendo su uso en la síntesis de novo.

La Solicitud de Patente Internacional WO 99/47536 desvela un procedimiento de síntesis génica en fase sólida en el que oligonucleótidos monocatenarios se ligan secuencialmente a una molécula iniciadora inmovilizada en una orientación definida. Una desventaja de este procedimiento es que son necesarias muchas etapas para sintetizar genes de mayor tamaño, dando como resultado un rendimiento reducido y un enriquecimiento de secuencias defectuosas. Además, este procedimiento es difícil de automatizar, lo cual es un requisito indispensable para una síntesis rápida normalizada.

La Solicitud de Patente Internacional WO 00/75368 desvela una síntesis en fase sólida combinatoria de ácidos nucleicos usando una genoteca de oligonucleótidos bicatenarios como componentes básicos normalizados. El uso de componentes básicos normalizados hace que sea innecesario sintetizar un nuevo conjunto de oligonucleótidos para cada nueva síntesis. Estos oligonucleótidos de genoteca bicatenarios comparten generalmente una estructura global idéntica y, por lo tanto, evitan los problemas de síntesis comunes causados por la formación de estructuras secundarias alternativas de los componentes básicos de oligonucleótidos, tales como la introducción de deleciones. En una versión preferida, contienen un bucle terminal, un tallo bicatenario y un saliente monocatenario corto. Hay dos clases diferentes de oligonucleótidos de genoteca,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar una genoteca de ácido nucleico que comprende una pluralidad de elementos, por lo que cada elemento de dicha genoteca de ácido nucleico comprende una primera extensión de nucleótidos, una segunda extensión de nucleótidos y una tercera extensión de nucleótidos, por lo que la secuencia de la primera extensión de nucleótidos y de la tercera extensión de nucleótidos son idénticas en cada elemento de la genoteca de ácido nucleico y los elementos de la genoteca de ácido nucleico difieren en la secuencia de la segunda extensión de nucleótidos, por lo que el procedimiento comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar un primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria que tiene un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de la primera o tercera extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico, por lo que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, b) proporcionar una primera genoteca de oligonucleótidos que comprende varios miembros, por lo que cada miembro es un segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria, por lo que el segundo oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario o parte del mismo es el mismo para los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos y por lo que dicho saliente monocatenario es esencialmente complementario al saliente monocatenario del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, por lo que la estructura bicatenaria comprende una extensión de nucleótidos, por lo que los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos difieren en la secuencia de dicha extensión de nucleótidos y la secuencia de dicha extensión de nucleótidos de los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos corresponde a la secuencia, o parte de la misma, de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico, c) combinar el primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y la primera genoteca de oligonucleótidos y ligar una molécula del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario con una molécula de cada miembro de la primera genoteca de oligonucleótidos mediante sus salientes monocatenarios, después de lo cual se forma un producto de primera ligación, d) cortar el producto de primera ligación con dicha segunda enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del miembro de la primera genoteca de oligonucleótidos, por lo que dicha escisión proporciona una pluralidad de primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, e) eliminar los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, f) proporcionar una segunda genoteca de oligonucleótidos que comprende varios miembros, por lo que cada miembro es un tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria, por lo que el tercer oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una tercera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento y un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario o parte del mismo es diferente para los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos, y por lo que dichos salientes monocatenarios o parte de los mismos del tercer oligonucleótido son esencialmente complementarios a los salientes monocatenarios de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados, y por lo que los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos comprenden una extensión de oligonucleótidos en la estructura bicatenaria que es idéntica en todos los miembros y corresponde a la secuencia, o parte de la misma, de la tercera o primera extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico, g) combinar la pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y la segunda genoteca de oligonucleótidos y ligar cada molécula de la pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados con una molécula de cada uno de los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos, por lo que el saliente monocatenario del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado es esencialmente complementario al saliente del tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, después de lo cual se forma un producto de segunda ligación, h) cortar el producto de segunda ligación con la tercera de enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico de los terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios, proporcionando una pluralidad de segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, i) eliminar los terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, j) proporcionar un cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria que tiene un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria al saliente monocatenario del segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado, por lo que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una cuarta enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, k) combinar el cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y la pluralidad de los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y ligar una molécula del cuarto oligonucleótido y cada molécula de la pluralidad de los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados formando un producto de tercera ligación;

l) cortar el producto de tercera ligación con la cuarta enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del cuarto oligonucleótido u oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios, proporcionando una pluralidad de terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado, y m) eliminar el cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, por lo que el procedimiento comprende además las etapas de:

n) repetir las etapas j) a m) como etapas ja) a ma) , por lo que el cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario de la etapa j) es un oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario adicional en la etapa ja) , el producto de tercera ligación en la etapa k) es un producto de ligación adicional en la etapa ka) , la pluralidad de terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados en la etapa l) es una pluralidad de oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados adicionales en la etapa la) , y el cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado de la etapa l) es un oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado adicional en la etapa la) .

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, por lo que después de la etapa de ligación ka) , el producto de ligación adicional se escinde, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado adicional.

4. Un procedimiento para preparar una genoteca de ácido nucleico que comprende una pluralidad de elementos, por lo que cada elemento de dicha genoteca de ácido nucleico comprende una primera extensión de nucleótidos, una segunda extensión de nucleótidos y una tercera extensión de nucleótidos, por lo que la secuencia de la primera extensión de nucleótidos y de la tercera extensión de nucleótidos son idénticas en cada elemento de la genoteca de ácido nucleico y los elementos de la genoteca de ácido nucleico difieren en la secuencia de la segunda extensión de nucleótidos, por lo que el procedimiento comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar un primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria que tiene un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de la primera o tercera extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico, por lo que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, b) proporcionar una primera genoteca de oligonucleótidos que comprende varios miembros, por lo que cada miembro es un segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria, por lo que el oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, y un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario o parte del mismo es el mismo para los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos, y por lo que dicho saliente monocatenario es esencialmente complementario al saliente monocatenario del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, por lo que la estructura bicatenaria comprende una extensión de nucleótidos por lo que los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos difieren en la secuencia de dicha extensión de nucleótidos y la secuencia de dicha extensión de nucleótidos de los miembros de la primera genoteca de oligonucleótidos corresponde a la secuencia, o parte de la misma, de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico, c) combinar el primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario y la primera genoteca de oligonucleótidos y ligar una molécula del primer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario con una molécula de cada miembro de la primera genoteca de oligonucleótidos mediante sus salientes monocatenarios, después de lo cual se forma un producto de primera ligación, d) cortar el producto de primera ligación con dicha segunda enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del miembro de la primera genoteca de oligonucleótidos, por lo que dicha escisión proporciona una pluralidad de primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, por lo que dicha pluralidad de primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados consiste en diversas especies moleculares que difieren en la secuencia del saliente monocatenario, e) eliminar los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, f) proporcionar una segunda genoteca de oligonucleótidos que comprende varios subgrupos de oligonucleótidos, y comprendiendo cada subgrupo varios miembros, por lo que cada miembro es un tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria, por lo que el tercer oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una tercera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento y un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario o parte del mismo es diferente de los diversos subgrupos de oligonucleótidos de la segunda genoteca de oligonucleótidos, y por lo que el saliente monocatenario, o parte del mismo, de cada subgrupo de la segunda genoteca de oligonucleótidos es esencialmente complementario al saliente monocatenario de cada especie molecular de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados, y por lo que los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos comprenden una extensión de nucleótidos en la estructura bicatenaria que es diferente en los miembros de cada subgrupo de la segunda genoteca de oligonucleótidos y corresponde a la secuencia, o parte de la misma, de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico, g) combinar la pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y la segunda genoteca de oligonucleótidos y ligar cada molécula de la pluralidad de los primeros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados con cada molécula de los miembros de la segunda genoteca de oligonucleótidos, por lo que se ligan aquellas moléculas cuyos salientes son esencialmente complementarios entre sí, después de lo cual se forman productos de segunda ligación, h) cortar los productos de segunda ligación con la tercera enzima de restricción de tipo II S, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, proporcionando una pluralidad de segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, por lo que dicha pluralidad de segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados consiste en diversos subgrupos que difieren en sus salientes monocatenarios, i) eliminar los terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, j) proporcionar una tercera genoteca de oligonucleótidos que comprende varios miembros, por lo que cada miembro es un cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria que tiene un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria a los salientes monocatenarios de los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y una extensión, preferentemente adyacente a dicho saliente, que es idéntica en los diversos miembros y proporciona la tercera o primera extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico, por lo que los miembros de la tercera genoteca de oligonucleótidos difieren en sus salientes monocatenarios y los salientes corresponden a la segunda extensión, o parte de la misma, de la genoteca de ácido nucleico, por lo que los oligonucleótidos comprenden un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una cuarta enzima de restricción de tipo IIS, que corta fuera de su sitio de reconocimiento, k) combinar la pluralidad de segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y la tercera genoteca de oligonucleótidos y ligar cada molécula de los miembros de la tercera genoteca de oligonucleótidos con cada molécula de la pluralidad de los segundos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados, por lo que se ligan aquellas moléculas cuyos salientes son esencialmente complementarios entre sí, después de lo cual se forma un producto de tercera ligación; l) cortar el producto de tercera ligación con la cuarta enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del miembro de la tercera genoteca de oligonucleótidos, proporcionando una pluralidad de terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y cuartos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, m) opcionalmente eliminar los cuartos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios acortados, n) proporcionar un quinto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene una estructura bicatenaria que tiene un saliente monocatenario, por lo que el saliente monocatenario proporciona una secuencia de nucleótidos esencialmente complementaria al saliente monocatenario de la pluralidad de terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados, por lo que el quinto oligonucleótido comprende un sitio de reconocimiento, o parte del mismo, para una quinta enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su sitio de reconocimiento, o) combinar la pluralidad de terceros oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y la cuarta genoteca de oligonucleótidos y ligar cada molécula de la pluralidad del tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado con una molécula del quinto oligonucleótido al menos bicatenario, después de lo cual se forma un producto de cuarta ligación; p) cortar el producto de cuarta ligación con la quinta enzima de restricción de tipo IIS, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del quinto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, proporcionando una pluralidad de cuartos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados y el quinto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado, q) opcionalmente eliminar el quinto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, por lo que el procedimiento comprende además las etapas de:

r) repetir las etapas n) a q) como etapas na) a qa) , por lo que el quinto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario de la etapa n) es un oligonucleótido al menos bicatenario adicional en la etapa na) , el producto de cuarta ligación en la etapa o) es un producto de ligación adicional en la etapa oa) , la pluralidad de cuartos oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados de la etapa p) es una pluralidad de oligonucleótidos al menos parcialmente bicatenarios alargados adicionales en la etapa pa) y el quinto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado de la etapa p) es un oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario acortado adicional en la etapa pa) .

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, por lo que después de la etapa de ligación oa) el producto de ligación adicional se escinde, por lo que la escisión se produce en la secuencia de ácido nucleico del oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario alargado adicional.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la primera enzima de restricción de tipo IIS se selecciona del grupo que comprende BpiI, BbsI, Esp3I, BsmBI, Eco31I, BsaI, BfuAI, FokI,

BseRI, BbvI y BsgI.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la segunda, tercera, cuarta, quinta y cualquier enzima de restricción de tipo IIS adicional se selecciona cada una e individualmente del grupo que comprende EarI, Eam1104I, SapI, LguI, Ksp632I y BspQI.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ácido nucleico es un ácido nucleico monocatenario y la longitud de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico consiste en dos nucleótidos, tres nucleótidos, cuatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, siete nucleótidos, ocho nucleótidos o múltiplos de tres nucleótidos.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el ácido nucleico es un ácido nucleico bicatenario y la longitud de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico consiste en dos nucleótidos, tres nucleótidos, cuatro nucleótidos, cinco nucleótidos, seis nucleótidos, siete nucleótidos, ocho nucleótidos o múltiplos de tres nucleótidos.

11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico está codificando uno o varios aminoácidos.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el segundo oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, el tercer oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, el cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario, el quinto y el oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario adicional comprenden una modificación, por lo que dicha modificación permite la inmovilización del oligonucleótido en una superficie.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, por lo que la modificación se selecciona del grupo que comprende un resto biotina, un resto de digoxigenina, un resto de isotiocianato de fluoresceína, un compuesto amino

o un éster de succinilo.

14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la genoteca de ácido nucleico es una genoteca de moléculas de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico funcional, por lo que dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende aptámeros, promotores, ribozimas y moléculas de mediación de iARN.

15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la genoteca de ácido nucleico es una genoteca de moléculas de ácido nucleico que codifican un péptido, polipéptido o proteína.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el péptido, polipéptido y proteína se seleccionan del grupo que comprende aptámeros peptídicos, enzimas, enzimas de restricción, dominios de unión a ADN, vacunas, anticuerpos, proteínas farmacéuticamente activas, anticalinas, DARPinas, nanocuerpos y AdNectinas.

17. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la genoteca de ácido nucleico es una genoteca de moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido, por lo que el polipéptido es un armazón que comprende una o varias regiones constantes, por lo que una o varias regiones variables y una o varias de las regiones variables están codificadas por la secuencia de la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico.

18. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la segunda extensión de nucleótidos de los elementos de la genoteca de ácido nucleico es la única diferencia entre dichos elementos.

19. Un procedimiento para la fabricación de una genoteca de moléculas de ácido nucleico, por lo que la genoteca de moléculas de ácido nucleico comprende una pluralidad de elementos, por lo que los elementos comprenden al menos una extensión constante y al menos una extensión variable, y por lo que la al menos una extensión constante comprende una secuencia de nucleótidos que es la misma en todos los elementos, y la al menos una extensión variable comprende una secuencia de nucleótidos que es diferente en todos los elementos, por lo que el procedimiento comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar un primer oligonucleótido, por lo que el primer oligonucleótido es un oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene un saliente monocatenario y comprende un sitio de reconocimiento para una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su secuencia de reconocimiento, o una genoteca de ácido nucleico que comprende una pluralidad de elementos, por lo que la genoteca de ácido nucleico es la genoteca de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y los elementos de la genoteca de ácido nucleico tienen un saliente monocatenario, y los elementos de la genoteca de ácido nucleico comprenden un sitio de reconocimiento para una primera enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su secuencia de reconocimiento; b) proporcionar un segundo oligonucleótido, por lo que dicho segundo oligonucleótido es una genoteca de ácido nucleico que comprende una pluralidad de elementos, por lo que la genoteca de ácido nucleico es la genoteca de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, y los elementos de la genoteca de ácido nucleico tienen un saliente monocatenario que es al menos parcialmente complementario al saliente monocatenario del oligonucleótido proporcionado en la etapa a) , los elementos de la genoteca de ácido nucleico comprenden un sitio de reconocimiento para una segunda enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su secuencia de reconocimiento, por lo que la segunda enzima de restricción de tipo IIS de los elementos de la genoteca de ácido nucleico es diferente de la primera enzima de restricción de tipo IIS del oligonucleótido proporcionado en la etapa a) ; c) combinar los oligonucleótidos de la etapa a) y la etapa b) y ligar una molécula del oligonucleótido de la etapa a) con cada molécula de cada elemento de la genoteca de ácido nucleico de la etapa b) mediante sus salientes monocatenarios con la condición de que el oligonucleótido de la etapa a) sea diferente de la genoteca de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18; o combinar los oligonucleótidos de la etapa a) y la etapa b) y ligar cada molécula de cada elemento de la genoteca de ácido nucleico de la etapa a) con cada molécula de cada elemento de la genoteca de ácido nucleico de la etapa b) mediante sus salientes monocatenarios con la condición de que el oligonucleótido de la etapa a) sea una genoteca de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18; d) opcionalmente eliminar reactivos y enzimas sin reaccionar, e) escindir el producto de ligación de la etapa c) con una enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su secuencia de reconocimiento, por lo que la escisión se produce en el oligonucleótido de la etapa a) o la etapa b) proporcionando una genoteca de moléculas de ácido nucleico prolongadas; y f) opcionalmente separar las moléculas de ácido nucleico prolongadas de la mezcla de reacción.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, por lo que la etapa a) a f) se repiten con la condición de que el oligonucleótido de la etapa a) sea un cuarto oligonucleótido que es una genoteca de moléculas de ácido nucleico prolongadas proporcionada en la etapa e) o un cuarto oligonucleótido al menos parcialmente bicatenario que tiene un saliente monocatenario que comprende un sitio de reconocimiento para una cuarta enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de su secuencia de reconocimiento; el oligonucleótido de la etapa b) es un tercer oligonucleótido que es una genoteca de moléculas de ácido nucleico prolongadas proporcionada en la etapa e) , por lo que el tercer y cuarto oligonucleótidos comprenden cada uno un saliente monocatenario y por lo que ambos salientes son al menos parcialmente complementarios entre sí; cuando se combinan los oligonucleótidos de la etapa a) y la etapa b) y se liga una molécula del oligonucleótido de la etapa a) con cada molécula de cada elemento de la genoteca de ácido nucleico de la etapa b) mediante sus salientes monocatenarios, el oligonucleótido de la etapa a) es diferente de la genoteca de moléculas de ácido nucleico prolongadas de la etapa b) ; o cuando se combinan los oligonucleótidos de la etapa a) y la etapa b) y se liga cada molécula de cada elemento de la genoteca de ácido nucleico de la etapa a) con cada molécula de cada elemento de la genoteca de ácido nucleico de la etapa b) mediante sus salientes monocatenarios, el oligonucleótido de la etapa a) es la genoteca de moléculas de ácido nucleico prolongadas de la etapa b) ; y en el que en la etapa e) se obtiene una genoteca adicional de moléculas de ácido nucleico prolongadas.

21. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, en el que la extensión variable o parte de la misma se proporciona por la segunda extensión de los elementos de la genoteca de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

22. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que la extensión constante o parte de la misma se proporciona por la primera extensión y/o la tercera extensión de los elementos de la genoteca de ácido nucleico como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

23. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la proporción de los diversos elementos y miembros de los genotecas usados en cualquiera de dichos procedimientos es equimolar.

24. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la proporción de los diversos elementos y miembros de las genotecas usados en cualquiera de dichos procedimientos no es equimolar o está sesgada.