Un procedimiento para seleccionar una célula hospedadora productora que expresa de maneraestable un polipéptido diana a un nivel elevado,

comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto al menos una célula hospedadora eucariota recombinante que contiene unpolipéptido recombinante, en el que el polipéptido recombinante comprende un elemento promotor; unpolinucleótido que codifica un polipéptido marcador superficial celular; y un polinucleótido que codifica unpolipéptido diana, en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido marcador superficial celularincluye un codón de inicio alternativo, en el que el polinucleótido marcador superficial celular y elpolinucleótido diana se transcriben sobre el mismo ARNm, y en el que la célula hospedadora se cultiva encondiciones de tal manera que el polipéptido marcador superficial celular se expresa en la superficie de lacélula hospedadora, con un agente detectable que reconoce y se une directa o indirectamente almarcador superficial celular si está presente sobre la superficie de la célula hospedadora, poniéndose encontacto el mencionado en contacto el mencionado en las condiciones que favorecen la unión del agentecon el marcador superficial celular;

(b) seleccionar una o más células hospedadoras que se unen directa o indirectamente al agente;

(c) preparar una o más poblaciones clonales de las células hospedadoras de la etapa (b) y;

(d) analizar una o más poblaciones clonales de la etapa (c) detectando el nivel de expresión del marcadorsuperficial celular sobre dichas poblaciones clonales y seleccionando una o más poblaciones clonales conun elevado nivel de expresión del marcador superficial celular, seleccionando por tanto una o máspoblaciones clonales que expresen de manera estable el polipéptido diana.

Un sistema basado en FACS y en la proteína indicadora para un desarrollo de alto rendimiento de proteínas terapéuticas

Notas:

El archivo contiene información técnica enviada tras la presentación de esta solicitud y no se ha incluido en esta memoria descriptiva.

SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/847.705, presentada el 27 de septiembre de 2006 y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/846.223, presentada el 20 de septiembre de 2006. Las enseñanzas completas de las anteriores solicitudes se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta divulgación se refiere en general a sistemas de alto rendimiento para identificar clones de elevada producción útiles para la producción de proteínas terapéuticas y diagnósticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La producción comercial de una proteína terapéutica requiere una línea celular estable de elevada expresión recombinante. Los procedimientos de la técnica anterior se han basado en líneas de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) para fabricar líneas de células clonales que producen la (s) proteína (s) . Se obtuvieron clones de elevada producción después de selección repetida basándose en la amplificación de combinados de células transfectadas utilizando tales agentes como metotrexato (MTX) . Este procedimiento lleva tiempo y necesita mucha mano de obra y no identifica específicamente los clones que producirán proteínas a elevados niveles.

Se han utilizado la citometría de flujo o las FACS para mejorar el desarrollo y la selección de líneas de células CHO de elevada producción. Esta tecnología ha permitido la rápida identificación y aislamiento de clones de elevada producción a partir de una población heterogénea de células transfectadas disminuyendo por tanto el trabajo y el tiempo asociados con los procedimientos de clonación aleatorios. Pueden identificarse las células deseadas sin necesidad de la amplificación de MTX repetida de los combinados.

Una vez que se han aislado los clones de células individuales mediante un procedimiento de clasificación basado en FACS, sin embargo, seleccionar un número adecuado de clones para aislar una línea de células estables de elevada producción sigue siendo un procedimiento que lleva tiempo. De este modo, un procedimiento de selección muy eficaz y preciso es extremadamente ventajoso en esta etapa de desarrollo de la línea celular. Además de implementar una selección en la etapa de desarrollo del clon en la placa de 96 pocillos, es deseable, por ejemplo que se centre adicionalmente en la expansión solo de los clones con elevada productividad. El análisis de la cosecha de los medios de cultivo celular se utiliza comúnmente para identificar los clones que secretan elevados niveles de una proteína terapéutica. Sin embargo, este procedimiento no es óptimo y no tiene en cuenta las diferencias tanto en la densidad celular como en el volumen de los medios entre pocillos. Como tal, puede no predecir de manera precisa los clones con elevada productividad específica y elevada titulación. También, debe emplearse esfuerzo más a menudo para desarrollar y optimizar un nuevo ensayo por cada proteína terapéutica de interés.

De esta manera, existe una necesidad en la técnica de composiciones y procedimientos para cribar poblaciones clonales para seleccionar líneas de células recombinantes que produzcan de manera estable elevados niveles de la proteína de interés. Esta invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas.

El documento WO 01/57212 da a conocer un procedimiento para identificar una célula hospedadora que presenta una expresión regulada de un gen de prueba proporcionando una pluralidad de células hospedadoras, comprendiendo cada célula hospedadora un polinucleótido, comprendiendo el polinucleótido en orden un promotor regulable; un gen de prueba; una secuencia IRES; y una secuencia de codificación de un marcador superficial, en la que el marcador superficial comprende una secuencia señal de secreción una proteína con etiqueta detectable, y un anclaje de la membrana, en el que la expresión de dicho gen de prueba da como resultado también la expresión de dicho marcador superficial; induciendo dicho promotor; y seleccionando una célula hospedadora que expresa dicho marcador superficial sobre su superficie..

GAINS P y col: "pIRES-CD4t, a dicistronic expression vector for MACS- or FACS-based selection of transfectedcells" BIOTECHNIQUES, Vol. 26, no.4, Abril de 1999, páginas 683 – 688, da a conocer un vector plásmido que dirige la expresión simultánea de los ADNc heterólogos, y un casete situado en 3’ que codifica un marcador CD4 truncado Un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis media en el inicio de la traducción desde este casete 3’, y un promotor del citomegalovirus impulsa la expresión del transcrito dicistrónico. MEDIN J A y col: "A bicistronic therapeutic retroviral vector enables sorting of transduced CD34 + cells and corrects the enzyme deficiency in cells from Gaucher patients" BLOOD, vol.87, no. 5, 1 de marzo de 1996, páginas 1754 – 1762, da a conocer un retrovirus recombinante bicistrónico que libera un ADNc de una glucocerebrosidasa terapéutica (GC) para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher, y un pequeño antígeno superficial celular de murino (antígeno térmicamente estable [HSA]) como un marcador seleccionable.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Se dan a conocer los procedimientos para identificar, seleccionar y producir una población de células hospedadoras eucariotas recombinantes que expresan de manera estable un polipéptido de interés (“polipéptido diana”) a elevados niveles, adecuado para la producción a gran escala del polipéptido diana. La célula hospedadora eucariota utilizada en estos procedimientos contiene o comprende un polinucleótido recombinante, en el que el polinucleótido recombinante comprende un elemento promotor; un polipéptido que codifica un polipéptido marcador superficial celular; un polinucleótido que codifica un polipéptido diana; y un polipéptido que tiene la actividad biológica de un polinucleótido de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) , y en el que el polinucleótido IRES se localiza dentro de polinucleótido recombinante de tal manera que el polinucleótido marcador superficial celular y el polinucleótido diana se transcriben en el mismo ARNm. En una realización alternativa, el polinucleótido recombinante incluye un codón de inicio alternativo para el inicio de la traducción. El codón de inicio alternativo puede estar en adición al elemento IRES o alternativamente, se puede sustituir por el elemento IRES. Las células hospedadoras recombinantes se unen mediante un agente que se une, directa o indirectamente al marcador superficial celular, y a continuación dichas células se seleccionan y aíslan. Las células seleccionadas y aisladas se preparan a continuación en una o más poblaciones clonales y se cultivan durante un periodo de tiempo. A continuación se analizan las poblaciones clonales detectando el nivel de expresión del marcador superficial celular de dicha población clonal y se seleccionan una o más poblaciones clonales con elevados niveles de expresión del marcador superficial celular. Las poblaciones clonales seleccionadas con elevados niveles de expresión del marcador superficial celular indican poblaciones clonales con niveles de expresión estables y elevador del polipéptido diana Las células seleccionadas mediante estos procedimientos se pueden cultivar adicionalmente en condiciones que permitan la producción del polipéptido diana que también está presente en la célula hospedadora. El polipéptido diana puede aislarse adicionalmente de las células o medios de cultivos de células según sea adecuado.

Se dan a conocer también en la presente memoria descriptiva los productos producidos por los procedimientos anteriormente señalados y los ensamblajes de componentes necesarios para llevar a cabo los procedimientos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un diagrama del casete de expresión génica. En una realización de esta invención,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para seleccionar una célula hospedadora productora que expresa de manera estable un polipéptido diana a un nivel elevado, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto al menos una célula hospedadora eucariota recombinante que contiene un polipéptido recombinante, en el que el polipéptido recombinante comprende un elemento promotor; un polinucleótido que codifica un polipéptido marcador superficial celular; y un polinucleótido que codifica un polipéptido diana, en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido marcador superficial celular incluye un codón de inicio alternativo, en el que el polinucleótido marcador superficial celular y el polinucleótido diana se transcriben sobre el mismo ARNm, y en el que la célula hospedadora se cultiva en condiciones de tal manera que el polipéptido marcador superficial celular se expresa en la superficie de la célula hospedadora, con un agente detectable que reconoce y se une directa o indirectamente al marcador superficial celular si está presente sobre la superficie de la célula hospedadora, poniéndose en contacto el mencionado en contacto el mencionado en las condiciones que favorecen la unión del agente con el marcador superficial celular;

(b) seleccionar una o más células hospedadoras que se unen directa o indirectamente al agente;

(c) preparar una o más poblaciones clonales de las células hospedadoras de la etapa (b) y;

(d) analizar una o más poblaciones clonales de la etapa (c) detectando el nivel de expresión del marcador superficial celular sobre dichas poblaciones clonales y seleccionando una o más poblaciones clonales con un elevado nivel de expresión del marcador superficial celular, seleccionando por tanto una o más poblaciones clonales que expresen de manera estable el polipéptido diana.

2. Un ensamblaje para seleccionar una célula hospedadora eucariota recombinante que expresa de forma estable y elevada un polipéptido diana, comprendiendo el ensamblaje los siguientes componentes:

(a) al menos una célula hospedadora eucariota recombinante que contiene un polinucleótido recombinante, en el que el polinucleótido recombinante comprende un elemento promotor; un polinucleótido que codifica un polipéptido marcador superficial celular; y un polinucleótido que codifica un polipéptido diana, en el que e polinucleótido que codifica el polipéptido marcador superficial celular incluye un codón de inicio alternativo, y en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido marcador superficial celular y el polinucleótido que codifica el polipéptido diana se transcriben en el mismo ARNm;

(b) un agente que se une directa o indirectamente al polipéptido marcador superficial celular; y

(c) un medio para detectar el agente cuando se une directa o indirectamente al polipéptido marcador superficial celular

3. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que la etapa (b) y/o la etapa (d) se lleva a cabo mediante clasificación celular activada por fluorescencia

4. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que la etapa (d) se lleva a cabo mediante clasificación celular activada por fluorescencia y en el que el perfil de clasificación celular activada por fluorescencia de una población clonal seleccionada en la etapa (d) indica una estrecha distribución alrededor del promedio, indicando por tanto una población clonal que expresa de manera estable el polipéptido diana.

5. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que la etapa (d) se lleva a cabo 7 – 28 días después de la etapa (c) .

6. El procedimiento de la Reivindicación 1, en el que el elevado nivel de expresión es un nivel de expresión del marcador superficial celular que es mayor que el nivel de expresión de al menos un 50, 70, 80, 90, o 95 o 99 % de las células analizadas en la etapa (b) y/o la etapa (d) .

7. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el promotor es un promotor eucariota.

8. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el polinucleótido marcador superficial celular codifica un marcador superficial celular diferente de un polipéptido CD4 o en el que el polinucleótido marcador superficial celular codifica un marcador superficial celular seleccionado entre el grupo que consiste de CD20, CD52 y CD59.

9. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el polipéptido diana comprende un polipéptido terapéutico o una proteína terapéutica.

10. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el promotor se localiza en la dirección 5’ del polinucleótido que codifica el polipéptido marcador superficial celular, o en la dirección 5’ del polinucleótido que codifica el polipéptido diana.

11. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el promotor se vincula operativamente al polinucleótido que codifica el polipéptido marcador superficial celular se vincula operativamente al polinucleótido que codifica el polipéptido diana.

12. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el polinucleótido recombinante comprende además un polinucleótido que aumenta o potencia la transcripción.

13. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que la célula hospedadora eucariota comprende además un segundo polinucleótido recombinante que codifica un segundo polipéptido diana bajo el control de un segundo elemento promotor.

14. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el polipéptido diana se selecciona entre el grupo que comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una hormona, una enzima, una proteína receptora, una proteína de trastorno lisosómico del almacenamiento, a-galactosidasa A, y una a-glucosidasa ácida.

15. El procedimiento de la Reivindicación 1 o el ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que la célula hospedadora eucariota es una célula de levadura o una célula de mamífero.

16. El ensamblaje de la Reivindicación 2, que comprende además:

(d) un medio para separar al menos una célula recombinante que tiene el agente unido directa o indirectamente al marcador superficial celular.

17. El ensamblaje de la Reivindicación 16, que comprende además

(e) un medio para hacer crecer la al menos una célula recombinante separada por el medio de un componente (d) .

18. El ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el agente del componente (b) es un anticuerpo etiquetado de manera detectable que se une directa o indirectamente al polipéptido marcador superficial celular codificado por el polinucleótido.

19. El ensamblaje de la Reivindicación 2, en el que el medio del componente (c) es un dispositivo para llevar a cabo la citometría de flujo.