Un casete de expresión que comprende una región promotora/potenciadora inmediata temprana 1 delCMV humano (hCMV IE1);

un polinucleótido de interés; un dominio de la señal de poliA de la hormona delcrecimiento humana; y una secuencia interviniente de longitud variable (VLIVS) que comprende un sitio donador decorte y empalme y un sitio aceptor de corte y empalme, en donde el dominio de la señal de poliA tiene una longitudde al menos 100 nucleótidos, contiene la secuencia AATAAA, y es idéntica en al menos un 92% a la secuenciaexpuesta en la SEQ ID NO: 18; y en donde la VLIVS comprende un intrón A de un gen hCMV IE1.

Un casete y vector de expresión para la expresión transitoria o estable de moléculas exógenas

CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere a vectores de expresión y casetes de expresión, y más en particular a procedimientos, composición, y sistemas para la expresión de una molécula exógena en un organismo.

ANTECEDENTES

La introducción de polipéptidos moleculares, péptidos, y moléculas pequeñas de ácidos nucleicos en células y tejidos diana se utiliza tanto para sistemas de administración terapéuticos como en la producción de moléculas terapéuticas in vitro. La aplicabilidad de este enfoque se ha incrementado con una mejor comprensión de las células hospedadoras y la biología molecular de los mecanismos celulares de división, diferenciación y expresión. El documento de EE.UU. 6.194.176 describe procedimientos para la producción de polipéptidos heterólogos utilizando una variedad de líneas de células secretoras manipuladas genéticamente de manera recombinante.

RESUMEN

Se ha descubierto que la transcripción conducida por un promotor del CMV y terminada por un dominio de poliA a partir de una variante del gen de la hormona del crecimiento humana (hGHv) es más eficiente que otros vectores de expresión que carecen de uno de los dos o de ambos elementos. Por tanto, la descripción, que incluye la presente invención, proporciona un casete de expresión y un vector de expresión útiles en la expresión de polinucleótidos de interés. El casete de expresión de la descripción, que incluye el casete de expresión de la invención, comprende una combinación de elementos reguladores que proporcionan una transcripción eficiente, una terminación de la transcripción eficiente y una estabilidad mejorada del ARNm de los productos transcritos. En la terminación de la transcripción, y en un caso de la descripción, el casete de expresión incluye un promotor/potenciador del citomegalovirus humano, un sitio de clonación o polinucleótido de interés, y un dominio de la señal de poliadenilación del hGHv. Opcionalmente, puede estar presente una secuencia interviniente de longitud variable.

La invención proporciona un casete de expresión que comprende una región promotora/potenciadora inmediata temprana 1 del CMV humano (hCMV IE1) ; un polinucleótido de interés; un dominio de la señal de poliA de la hormona del crecimiento humana; y una secuencia interviniente de longitud variable (VLIVS) que comprende un sitio donador de corte y empalme y un sitio aceptor de corte y empalme, en donde el dominio de la señal de poliA tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos, contiene la secuencia AATAAA, y es idéntica en al menos un 92% a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 18; y en donde la VLIVS comprende un intrón A de un gen hCMV IE1.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión que incluye un casete de expresión de la invención así como células hospedadoras que contienen un casete de expresión o un vector de expresión de la invención.

La descripción también incluye un procedimiento de administración de un agente de interés in vivo. El procedimiento incluye la administración a un sujeto de una composición que comprende un casete de expresión. El casete de expresión incluye una región promotora/potenciadora hCMV IE1, una secuencia interviniente de longitud variable que comprende un sitio donador de corte y empalme y un sitio aceptor de corte y empalme; un polinucleótido que codifica el agente de interés; y un dominio de la señal de poliA de la hormona del crecimiento humana (hGH) o una de sus variantes.

La descripción además incluye un sistema de expresión. El sistema de expresión incluye una célula hospedadora transfectada o transformada con un casete de expresión de la invención, en donde las células hospedadoras se cultivan en condiciones para la expresión el polinucleótido de interés; y la recuperación del agente de interés.

La presente invención y sus formas de realización se presentan en las reivindicaciones anexas. Los detalles de la invención se exponen en los dibujos acompañantes y la descripción siguiente. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es el mapa plasmídico del vector pV10. El promotor inmediato temprano 1 de citomegalovirus (CMV IE1) /intrón (IVS) se generó por PCR y se clonó en los sitios HindIII y BamHI. También se indica el gen de resistencia a ampicilina, º lactamasa (bla) .

La Figura 2 es el mapa plasmídico del vector pV40. Se indica el promotor inmediato temprano 1 de citomegalovirus (CMV IE1) , un intrón (IVS) , un dominio de la señal de poliadenilación (poliA) de hGHv de una longitud de aproximadamente 600 pares de bases, y el gen de resistencia a ampicilina, º lactamasa (bla) .

La Figura 3 es una representación esquemática del plásmido pV70. Se indican el promotor CMV IE1, la IVS que incluye la unión de supresión y los sitios donador de corte y empalme (SD) y aceptor de corte y empalme (SA) , un dominio de la señal de poliA de la hGHv, y el gen bla. La unión de eliminación representa el resultado de la ligación de los extremos romos de BspB1'/'HpaI.

La Figura 4 es una representación esquemática de la generación del vector pXLC.1. El vector pXLC.1 se construyó utilizando el vector de expresión pV70 y un producto de la PCR que contiene la secuencia codificante de la cadena ligera. pV70 se linealizó con BamHI, el producto de la PCR se digirió con BamHI y estos dos fragmentos se ligaron para generar el vector pXLC.1.

La Figura 5 es una representación esquemática de la generación del vector pXLC.2.

La Figura 6 es una representación esquemática de un vector pV60 y la generación del vector pXHC. El vector pXHC se construyó utilizando el vector de expresión pV60 y un producto de la PCR que contiene la mayor parte de la secuencia codificante de la cadena pesada (no se han incluido 52 aminoácidos a partir del extremo Nterminal) . pV60 se linealizó con BamHI, el producto de la PCR se digirió con BamHI y estos dos fragmentos se ligaron.

La Figura 7 es una representación esquemática de un vector pXHC.1.

La Figura 8 es una representación esquemática de un vector pXHC.3.

La Figura 9 es una representación esquemática de un vector pXHC.5, resultado de la adición de un casete dhfr a pXHC.3. Los elementos de control del casete de expresión se obtuvieron en pSI (Promega, Nº de acceso del Genbank #U47121) e incluyen el promotor/potenciador de SV40, un intrón artificial y la secuencia de poliadenilación tardía de SV40.

La Figura 10 es una representación esquemática del vector pV80. Se indican un fragmento del promotor inmediato temprano 1 de citomegalovirus (CMV IE1) /intrón (IVS) que incluye los sitios donador de corte y empalme (SD) y aceptor de corte y empalme (SA) , un dominio de la señal de poliadenilación (poliA) de hGHv, el gen de resistencia a ampicilina, º lactamasa (bla) , el intrón artificial del promotor/potenciador de SV40 y la secuencia de poliadenilación tardía de SV40.

Las Figuras 11A y 11B son representaciones esquemáticas del vector pV90 y las secuencias anotadas correspondientes. La Figura 11A es un mapa del vector. Se indican un fragmento del promotor inmediato temprano 1 de citomegalovirus (CMV IE1) /intrón (IVS) que incluye los sitios donador de corte y empalme (SD) y aceptor de corte y empalme (SA) , un dominio de la señal de poliadenilación (poliA) de hGHv, el gen de resistencia a ampicilina, ºlactamasa (bla) , el intrón artificial y la secuencia de poliadenilación tardía de SV40. El vector carece del sitio NotI en el casete de expresión dhfr. La Figura 11B es la secuencia anotada del vector pV90. En la Fig. 11B, la secuencia a partir de los nucleótidos 1275 a 1866 de la SEQ ID NO: 19 representa una señal de poliA de la hGHv de una longitud de aproximadamente 600 nucleótidos.

La Figura 12 es un mapa del vector pSI-DBFR.2. El promotor de SV40 dirige el gen dhfr.

La Figura 13 es una gráfica que representa las productividades específicas relativas de las fracciones reunidas de muestras transfectadas. Se analizaron tres fracciones reunidas de muestras para pCMV-hGHvEA-SEAP y pSEAP2, y uno para pUC18.

La Figura 14 es un par de gráficas que muestran las productividades específicas relativas de las... [Seguir leyendo]

1. Un casete de expresión que comprende una región promotora/potenciadora inmediata temprana 1 del CMV humano (hCMV IE1) ; un polinucleótido de interés; un dominio de la señal de poliA de la hormona del crecimiento humana; y una secuencia interviniente de longitud variable (VLIVS) que comprende un sitio donador de corte y empalme y un sitio aceptor de corte y empalme, en donde el dominio de la señal de poliA tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos, contiene la secuencia AATAAA, y es idéntica en al menos un 92% a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 18; y en donde la VLIVS comprende un intrón A de un gen hCMV IE1.

2. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que la región promotora/potenciadora hCMV IE1 comprende una secuencia entre el nucleótido x1 y el nucleótido x2 de la SEQ ID NO: 1, en la que x1 denota un nucleótido desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 20 de la SEQ ID NO: 1 y x2 denota un nucleótido desde el nucleótido 715 hasta el nucleótido 720 de la SEQ ID NO: 1.

3. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el casete de expresión comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1.

4. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el casete de expresión comprende una secuencia complementaria a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1.

5. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el casete de expresión comprende una secuencia al menos un 80% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o su complementario.

6. El casete de expresión de la reivindicación 5, en el que el casete de expresión comprende una secuencia al menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o su complementario.

7. El casete de expresión de la reivindicación 6, en el que el casete de expresión comprende una secuencia al menos un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o su complementario.

8. Los casetes de expresión de la reivindicación 7, en los que el casete de expresión comprende una secuencia al menos un 97% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o su complementario.

9. El casete de expresión de la reivindicación 8, en el que el casete de expresión comprende una secuencia al menos un 98% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o su complementario.

10. El casete de expresión de la reivindicación 9 en el que el casete de expresión comprende una secuencia al menos un 99% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o su complementario.

11. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el casete de expresión comprende la secuencia entre el nucleótido 1 y el nucleótido 1867 de la SEQ ID NO: 1.

12. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que la VLIVS comprende un intrón A de un gen hCMV IE1 que tiene una supresión entre el aceptor de corte y empalme y el donador de corte y empalme del intrón

A.

13. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que la VLIVS comprende una secuencia entre el nucleótido x3 y el nucleótido x4 de la SEQ ID NO: 1, en la que x3 denota un nucleótido desde el nucleótido 715 hasta el nucleótido 720 de la SEQ ID NO: 1 y x4 denota un nucleótido desde el nucleótido 1236 hasta el nucleótido 1254 de la SEQ ID NO: 1.

14. El casete de expresión de la reivindicación 1, que comprende además un elemento promotor/potenciador o región reguladora adicional.

15. El casete de expresión de la reivindicación 14, en el que el elemento promotor/potenciador es un elemento promotor/potenciador de SV40.

16. El casete de expresión de la reivindicación 14, en el que la región reguladora es una región de poliadenilación de SV40.

17. El casete de expresión de la reivindicación 1, que comprende además un marcador seleccionable.

18. El casete de expresión de la reivindicación 17, en el que el marcador seleccionable se selecciona del grupo constituido por la dihidrofolato reductasa, GPF, neomicina, Higro, Zeocin™, timidina quinasa del herpesvirus simplex, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, adenina fosforribosiltransferasa, puromicina N-acetiltransferasa

o adenosina desaminasa.

19. El casete de expresión de la reivindicación 17, en el que el marcador seleccionable es la dihidrofolato reductasa.

20. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido de interés codifica un agente terapéutico.

21. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido de interés está en la orientación no codificante con respecto al promotor.

22. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido de interés es un polinucleótido heterólogo.

23. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido de interés incluye, además, elementos de control de la transcripción.

24. El casete de expresión de la reivindicación 23, en el que los elementos de control de la transcripción se seleccionan del grupo constituido por señales de detención de la transcripción, dominios de poliadenilación y elementos potenciadores en dirección 3’.

25. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido de interés codifica un polipéptido de uso diagnóstico o terapéutico.

26. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido de interés codifica un polipéptido antigénico para su uso como una vacuna.

27. El casete de expresión de la reivindicación 1, en el que el dominio de la señal de poliA comprende al menos 100 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 19.

28. El casete de expresión de la reivindicación 27, en el que el dominio de la señal de poliA comprende la SEQ ID NO: 19.

29. El casete de expresión de la reivindicación 27, en el que el dominio de la señal de poliA es la SEQ ID NO: 19.

30. El casete de expresión de la reivindicación 1 en la forma de construcción de ácido nucleico desnudo.

31. Un polinucleótido que se hibrida específicamente con una secuencia de polinucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 1867 o un fragmento de la misma.

32. Un vector de expresión que comprende un casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

33. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión de la reivindicación 32.

34. Una célula hospedadora que comprende un casete de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30.

35. Un procedimiento in vitro para producir un polipéptido que comprende la propagación de una célula hospedadora de la reivindicación 33 o la reivindicación 34 y la expresión del polinucleótido de interés.

36. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que el polinucleótido de interés codifica un agente terapéutico y el procedimiento comprende la recuperación del agente terapéutico.

37. El uso de un casete de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 o un vector de expresión de la reivindicación 32 para la fabricación de un medicamento para su uso en terapia génica.

38. El vector genético pV40, que comprende, en orden:

a. un promotor inmediato temprano 1 de citomegalovirus (CMV IE1) ,

b. un intrón;

c. un dominio de la señal de poliadenilación (poliA) de hGHv como se establece en la SEQ ID NO: 19; y

d. un gen de la ºlactamasa (bla) ;

en donde dicho vector genético se puede obtener mediante el uso de los cebadores de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 para amplificar un fragmento que contiene el promotor IE1 de CMV y el intrón adyacente a partir del ADN genómico de fibroblastos diploides humanos que están infectados con la cepa AD169 de citomegalovirus humano depositada en la ATCC con el número de acceso ATCC VR-538; la digestión del fragmento resultante con BamHI y HindIII; la inserción de dicho fragmento digerido en un vector pUC19 que se digiere con BamHI y HindIII, para así formar el vector pV10; utilizando los cebadores de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 para amplificar un fragmento que contiene el dominio de la señal de poliA de la hGHv a partir del ADN genómico de fibroblastos humanos; digiriendo el fragmento resultante con BamHI y EcoRI; e insertando dicho fragmento digerido en dicho vector pV10 que se digiere con BamHI y EcoRI.

39. El vector genético pV60, que se puede obtener a partir del vector genético pV40 según la reivindicación 38 mediante la sustitución de la región de 317 pares de bases entre los sitios BspEI y HpaI dentro del intrón de pV40 con una región codificante dhfr.

40. El vector genético pV70, que se puede obtener a partir del vector genético pV40 según la reivindicación 38 mediante la supresión de la región de 317 pares de bases entre los sitios BspEI y HpaI dentro del intrón de pV40.

41. El vector genético pXLC.1, que se puede obtener a partir del vector genético pV70 tal como se define en la reivindicación 40 mediante la inserción de una secuencia de ADNc que codifica para la cadena ligera de un anticuerpo en el único sitio BamHI en el extremo 3' de dicho intrón.

42. El vector genético pXLC.2, que se puede obtener a partir del vector genético pXLC.1 tal como se define en la reivindicación 41 por escisión del fragmento BamHI/EcoRI que contiene el neo casete del plásmido pGT-N28; la conversión del extremo BamHI de dicho fragmento en un extremo NarI por ligación de dicho fragmento a los oligonucleótidos adaptadores de la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; y la inserción del fragmento resultante en dicho vector XLC.1 que se digiere con NarI y EcoRI.

43. El vector genético pXHC.1, que se puede obtener a partir del vector genético de pV60 tal como se define en la reivindicación 39 mediante la inserción de una secuencia codificante de ADNc para la cadena pesada de un anticuerpo en el sitio BamHI único en el extremo 3’ de dicho intrón.

44. El vector genético pXHC.3, que es idéntico al vector genético pXHC.1 tal como se define en la reivindicación 43, excepto porque carece de la región codificante dhfr dentro de dicho intrón.

45. El vector genético pXHC.5, que se puede obtener a partir del vector genético de pXHC.3 tal como se define en la reivindicación 44 por escisión del fragmento BglII/BamHI que contiene el promotor temprano de SV40, el gen dhfr, y la región poliA de SV40 del plásmido pSI-DHFR, la digestión del plásmido pXHC.3 con EcoRI para producir extremos EcoRI; la ligación de los extremos EcoRI a los oligonucleótidos adaptadores de la SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 para producir extremos compatibles con BgIII/BamHI; y la ligación de dicho fragmento BglII/BamHI a partir del plásmido pSI-DHFR a dichos extremos compatibles, para formar así dicho vector genético pXHC.5.

46. El vector genético pV80, que se puede obtener a partir del vector genético pXHC.5 tal como se define en la reivindicación 45 por escisión de la secuencia codificante de la cadena pesada a partir de pXHC.5 utilizando BamHI.

47. El vector genético pV90 como se expone en la SEQ ID NO: 1.