Sistema novedoso de expresión génica inducible basado en el receptor de ecdisona/receptor X retinoide de invertebrado.

Un sistema de modulación de la expresión génica que comprende:

a) un primer casete de expresión génica que es capaz de expresarse en una célula huésped, que comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:

i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se tiene que modular; y

ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y

b) un segundo casete de expresión génica que es capaz de expresarse en la célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:

i) un dominio de transactivación; y

ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero.

Sistema novedoso de expresión génica inducible basado en el receptor de ecdisona/receptor X retinoide de invertebrado

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biotecnología o de la ingeniería genética. Específicamente, la 5 presente invención se refiere al campo de la expresión génica. Más específicamente, la presente invención se refiere a un novedoso sistema de expresión génica inducible basado en el receptor de ecdisona/receptor X retinoide de invertebrados y a procedimientos para modular la expresión de un gen dentro de una célula huésped usando este sistema de expresión génica inducible.

Antecedentes de la invención 10

Diversas citas de cualquier referencia en el presente documento no se deben interpretar como una admisión de que tal referencia está disponible como “Técnica Anterior” para la presente solicitud.

En el campo de la ingeniería genética, el control exacto de la expresión génica es una herramienta valiosa para estudiar, manipular y controlar el desarrollo y otros procedimientos fisiológicos. La expresión génica es un procedimiento biológico complejo que implica varias interacciones proteína-proteína específicas. Con el fin de 15 desencadenar la expresión génica, de forma que se produzca el ARN necesario como primera etapa en la síntesis de proteínas, se tiene que poner un activador transcripcional en proximidad de un promotor que controle la transcripción génica. Normalmente, el propio activador transcripcional está asociado con una proteína que tiene al menos un dominio de unión a ADN que se une a sitios de unión a ADN presentes en las regiones promotoras de los genes. Por tanto, para que se produzca la expresión génica, en la región promotora del gen, una proteína que 20 comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de transactivación localizado a una distancia apropiada del dominio de unión a ADN se tiene que poner en la posición correcta.

El enfoque transgénico tradicional usa un promotor específico de tipo celular para activar la expresión de un transgen diseñado. Una construcción de ADN que contiene el transgen se incorpora en primer lugar en un genoma huésped. Cuando se desencadena por un activador transcripcional, la expresión del transgen se produce en un tipo 25 celular determinado.

Otro medio para regular la expresión de genes extraños en células es a través de promotores inducibles. Ejemplos del uso de tales promotores inducibles incluyen el promotor PR1-a, sistemas procariotas de represor-operador, sistemas inmunosupresores-inmunofilina y sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores tales como los sistemas de receptores de hormonas esteroideas y se describen más adelante. 30

El promotor PR1-a del tabaco se induce durante la respuesta de resistencia adquirida sistémica después de un ataque por patógenos. El uso de PR1-a puede estar limitado debido a que con frecuencia responde a materiales endógenos y a factores externos tales como patógenos, radiación UV-B, y contaminantes. Se han descrito sistemas de regulación génica basados en promotores inducidos por choque térmico, interferón y metales pesados (Wum y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5414-5418; Arnheiter y col., 1990, Cell 62: 51-61; Filmus y col., 1992, 35 Nucleic Acids Research 20: 27550-27560) . Sin embargo, estos sistemas tienen limitaciones debido a su efecto sobre la expresión de genes no dirigidos. Estos sistemas son también parciales.

Los sistemas procariotas de represor-operador usan proteínas represoras bacterianas y las secuencias de ADN operador únicas a las cuales se unen. Para controlar la expresión génica, se han usado sistemas de represor-operador, tanto de tetraciclina (“Tet”) como de lactosa (“Lac”) , de la bacteria Escherichia coli en plantas y en 40 animales. En el sistema Tet, la tetraciclina se une a la proteína represora TetR, dando como resultado un cambio conformacional que libera la proteína represora del operador lo cual permite como resultado que ocurra la transcripción. En el sistema Lac, un operón Lac se activa como respuesta a la presencia de lactosa o análogos sintéticos tales como isopropil-b-D-tiogalactósido. Desafortunadamente, el uso de tales sistemas está limitado por la química inestable de los ligandos, es decir tetraciclina y lactosa, su toxicidad, su presencia natural o los niveles 45 relativamente elevados necesarios para la inducción o represión. Por razones similares, la utilidad de tales sistemas en animales está limitada.

Las moléculas inmunosupresoras tales como FK506, rapamicina y ciclosporina A se pueden unir a inmunofilinas FKBP12, ciclofilinas, etc. Usando esta información, se ha concebido una estrategia general para unir dos proteínas cualquiera simplemente colocando FK506 en cada una de las dos proteínas o colocando FK506 en una y 50 ciclosporina A en otra. Después, para inducir la dimerización de estas moléculas, puede usarse un homodímero sintético de FK506 (FK1012) o un compuesto resultante de la fusión de FK506-ciclosporina (FKCsA) Spencer y col., 1993, Science 262: 1019-24; Belshaw y col., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93: 4604-7) . El dominio de unión a ADN Gal4 fusionado a FKBP12 y el dominio activador VP16 fusionado a ciclofilina y el compuesto FKCsA se usaron para mostrar la heterodimerización y la activación de un gen indicador bajo el control de un promotor que contenía sitios 55 de unión a Gal4. Desafortunadamente, este sistema incluye inmunosupresores que pueden tener efectos secundarios no deseados y por lo tanto, limita su uso para diversas aplicaciones de cambio génico en mamíferos.

También se han empleado sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores tales como el sistema de receptor de hormona esteroidea. Los receptores de hormona esteroidea son miembros de la superfamilia de los receptores nucleares y se encuentra en células de vertebrados e invertebrados. Desafortunadamente, el uso de compuestos esteroideos que activan a los receptores para la regulación de la expresión génica, particularmente en plantas y en mamíferos, está limitado debido a su implicación en muchas otras rutas biológicas naturales en tales 5 organismos. Con el fin de superar tales dificultades, se ha desarrollado un sistema alternativo usando receptores de ecdisona de insectos (EcR) .

El crecimiento, la muda y el desarrollo en los insectos están regulados por la hormona esteroidea ecdisona (hormona de la muda) y las hormonas juveniles (Dhadialla, y col., 1998, Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569) . La diana molecular para la ecdisona en insectos consiste en al menos un receptor de ecdisona (EcR) y proteína 10 ultraespiráculo (USP) . El EcR es un miembro de la superfamilia de receptores esteroideos nucleares que se caracteriza por dominios de unión a ADN y a ligandos distintivos y un dominio de activación (Koelle y col. 1991, Cell, 67: 59-77) . Los receptores EcR son responsables de varios compuestos esteroideos tales como ponasterona A y muristerona A. Recientemente, se han descrito compuestos no esteroideos con actividad agonista de ecdicteroide, incluyendo los insecticidas disponibles en el mercado tebufenozida y metoxifenozida que se comercializan en todo el 15 mundo por Rohm and Haas Company (véase Solicitud de Patente Internacional Nº PGT/EP96/00686 y la Patente de Estados Unidos 5.530.028) . Ambos análogos tienen perfiles de seguridad excepcionales para otros organismos.

Las Solicitudes de Patente Internacional Nº PCT/US97/05330 (WO 97/38117) y PGT/US99/08381 (WO99/58155) desvelan procedimientos para modular la expresión de un gen exógeno en el cual una construcción de ADN que comprende el gen exógeno y un elemento de respuesta de ecdisona se activan mediante una segunda construcción 20 de ADN que comprende un receptor de ecdisona que, en presencia de un ligando para el mismo, y opcionalmente en presencia de un receptor capaz de actuar como un compañero silencioso, se une al elemento de respuesta de ecdisona para inducir la expresión génica. El receptor de ecdisona de deleción se aisló de Drosophila melanogaster. Normalmente, tales sistemas requieren la presencia del compañero silencioso, preferentemente un receptor X retinoide (RXR) , con el fin de proporcionar una activación óptima. En células de mamífero, el receptor de ecdisona 25 de insectos (EcR) se heterodimeriza con el receptor X retinoide (RXR) y regula la expresión de genes diana de una manera dependiente de ligando. La Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/US98/14215 (WO 99/02683) divulga que el receptor de ecdisona aislado... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de modulación de la expresión génica que comprende:

a) un primer casete de expresión génica que es capaz de expresarse en una célula huésped, que comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:

i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya 5 expresión se tiene que modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y b) un segundo casete de expresión génica que es capaz de expresarse en la célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:

i) un dominio de transactivación; y 10

ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero.

2. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo además un tercer casete de expresión génica que comprende:

i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;

ii) un promotor que se activa mediante el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y 15

iii) un gen cuya expresión se tiene que modular.

3. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a ligando (DUL) de receptor de ecdisona del primer polipéptido híbrido se selecciona entre el grupo que consiste en un DUL de EcR del gusano del brote de la picea Choristoneura fumiferana ("CfEcR") , un DUL de EcR del escarabajo Tenebrio molitor ("TmEcR") , un DUL de EcR de Manduca sexta ("MsEcR") , un DUL de EcR de Heliothies virescens 20 ("HvEcR") , un DUL de EcR de mosquito Chironomus tentans ("CtEcR") , un DUL de EcR de mariposa de la seda Bombyx mori ("BmEcR") , un DUL de EcR de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster ("DmEcR") , un DUL de EcR del mosquito Aedes aegypti ("AaEcR") , un DUL de EcR de la mosca azul Lucilia capitata ("LcEcR") , un DUL de EcR de la mosca azul Lucilia cuprina ("LucEcR") , un DUL de EcR de la mosca de la fruta mediterránea Ceratisis capitata ("CcEcR") , un DUL de EcR de la langosta migratoria Locusta migratoria ("LmEcR") , un DUL de EcR del 25 áfido Mycus persicae ("MpEcR") , un DUL de EcR del cangrejo violinista Celuca pugilator ("CpEcR") , un DUL de EcR de la garrapata solitaria Amblyomma americanum ("AmaEcR") , un DUL de EcR de la mosca blanca Bamecia argentifoli ("BaEcR") , y un DUL de EcR de cicadélido Nephotetix cincticeps ("NcEcR") .

4. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona del primer polipéptido híbrido es codificado por una secuencia de ácido nucleico 30 seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 53 y SEC ID Nº: 45.

5. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona del primer polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 43 y SEC ID Nº: 59.

6. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión 35 a ligando de receptor X retinoide de invertebrado del segundo polipéptido híbrido es codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20.

7. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los dominios de 40 unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado del segundo polipéptido híbrido comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32.

8. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primer casete de 45 expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio de unión a ADN GAL4 y un dominio de unión a ADN LexA y un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona.

9. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende un 50 dominio de transactivación seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio de transactivación VP16 y un dominio de transactivación activador ácido B42 y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado.

10. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en un AD VP16 (SEC ID Nº: 37) y un AD B42 (SEC ID Nº: 39) y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 5 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20.

11. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste 10 en un AD VP16 (SEC ID Nº: 38) y un AD B42 (SEC ID Nº: 40) y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32.

12. Un sistema de modulación de la expresión génica que comprende: 15

a) un primer casete de expresión génica que es capaz de expresarse en una célula huésped, que comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:

i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se tiene que modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero; y 20

b) un segundo casete de expresión génica que es capaz de expresarse en la célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:

i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona.

13. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además 25 un tercer casete de expresión génica que comprende:

i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;

ii) un promotor que se activa mediante el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se tiene que modular.

14. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de 30 unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado del primer polipéptido híbrido es codificado por un polipéptido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20.

15. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de 35 unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado del primer polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32.

16. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de 40 unión a ligando de receptor de ecdisona del segundo polipéptido híbrido se selecciona entre el grupo que consiste en un DUL de EcR del gusano del brote de la picea Choristoneura fumiferana ("CfEcR") , un DUL de EcR del escarabajo Tenebrio molitor EcR ("TmEcR") , un DUL de EcR de Manduca sexta ("MsEcR") , un DUL de EcR de Heliothies virescens ("HvEcR") , un DUL de EcR del mosquito Chironomus tentans ("CtEcR") , un DUL de EcR de la mariposa de la seda Bombyx mori ("BmEcR") , un DUL de EcR de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster 45 ("DmEcR") , un DUL de EcR del mosquito Aedes aegypti ("AaEcR") , un DUL de EcR de la mosca azul Lucilia capitata ("LcEcR") , un DUL de EcR de la mosca azul Lucilia cuprina ("LucEcR") , un DUL de EcR de la mosca de la fruta mediterránea Ceratisis capitata ("CcEcR") , un DUL de EcR de langosta migratoria Locusta migratoria ("LmEcR") , un DUL de EcR del áfido Mycus persicae ("MpEcR") , un DUL de EcR del cangrejo violinista Celuca pugilator ("CpEcR") , un DUL de EcR de la garrapata solitaria Amblyomma americanum ("AmaEcR") , un DUL de EcR de la mosca blanca 50 Bamecia argentifoli ("BaEcR") y un DUL de EcR del cicadélido Nephotetix cincticeps ("NcEcR") .

17. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona del segundo polipéptido híbrido es codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 53 y SEC ID Nº: 45. 55

18. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona del segundo polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 43 y SEC ID Nº: 59.

19. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el primer casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende un 5 dominio de unión a ADN seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio de unión a ADN GAL4 y un dominio de unión a ADN LexA y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado.

20. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el primer casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico 10 seleccionada entre el grupo que consiste en un DUA GAL4 (SEC ID Nº: 33) o un DUA LexA (SEC ID Nº: 35) y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20. 15

21. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el primer casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en un DUA GAL4 (SEC ID Nº: 34) y un DUA LexA (SEC ID Nº: 36) y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste 20 en SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30 y SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32.

22. El sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el segundo casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación seleccionado entre el grupo que consiste en un dominio de transactivación 25 VP16 y un dominio de transactivación activador ácido B42 y un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona.

23. Un casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero, en el que el dominio de unión a ADN es de un receptor nuclear diferente a un receptor X retinoide de invertebrado. 30

24. El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el dominio de unión a ADN es un dominio de unión a ADN GAL4 o un dominio de unión a ADN LexA.

25. El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que 35 consiste en un DUA GAL4 (SEC ID Nº: 33) y un DUA LexA (SEC ID Nº: 35) y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20. 40

26. El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de unión a ADN que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en un DUA GAL4 (SEC ID Nº: 34) y un DUA LexA (SEC ID Nº: 36) y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 45 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32.

27. Un casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero, en el que el dominio de transactivación es de un receptor nuclear diferente a un receptor X 50 retinoide de invertebrado.

28. El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el dominio de transactivación es un dominio de transactivación VP 16 o un dominio de transactivación activador ácido B42.

29. El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación 55 codificado por un polipéptido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en un AD VP16 (SEC ID Nº: 37) y un AD B42 (SEC ID Nº: 39) y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20.

30. El casete de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el casete de expresión génica comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido híbrido que comprende un dominio de transactivación que 5 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en un AD VP16 (SEC ID Nº: 38) y un AD B42 (SEC ID Nº: 40) y un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado que comprende una secuencia de aminoácidos, seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32. 10

31. Un polinucleótido aislado seleccionado entre el grupo que consiste en.

(a) un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero truncado que comprende una mutación de truncamiento, en el que la mutación de truncamiento reduce la actividad de unión a ligando del dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado; 15

(b) un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero truncado que comprende una mutación de truncamiento, en el que la mutación de truncamiento reduce la actividad de unión a esteroide del dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado;

(c) un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no 20 lepidóptero, no díptero truncado que comprende una mutación de truncamiento, en el que la mutación de truncamiento reduce la actividad de unión a no esteroide del dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado;

(d) un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero truncado que comprende una mutación de truncamiento, en el que la mutación de 25 truncamiento potencia la actividad de unión a ligando del dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado;

(e) un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero truncado que comprende una mutación de truncamiento, en el que la mutación de truncamiento potencia la actividad de unión a esteroide del dominio de unión a ligando de receptor X retinoide 30 de invertebrado truncado;

(f) un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero truncado que comprende una mutación de truncamiento, en el que la mutación de truncamiento potencia la actividad de unión a no esteroide del dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado; 35

(g) un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no lepidóptero, no díptero truncado que comprende una mutación de truncamiento, en el que la mutación de truncamiento aumenta la sensibilidad a ligando del dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado; y (h) un polinucleótido que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado no 40 lepidóptero, no díptero truncado que comprende una mutación de truncamiento, en el que la mutación de truncamiento aumenta la sensibilidad a ligando de un heterodímero, en el que el heterodímero comprende dicho dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado y un compañero de dimerización.

32. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el compañero de dimerización es un 45 polipéptido de receptor de ecdisona.

33. Un polinucleótido aislado que codifica un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20.

34. Un polipéptido aislado codificado por el polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 33. 50

35. Un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide de invertebrado truncado aislado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 32.

36. Un procedimiento para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de:

a) introducir en la célula huésped el sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la 55 reivindicación 1 y b) introducir en la célula huésped un ligando;

en el que el gen que se tiene que modular es un componente de un casete de expresión génica que comprende:

i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;

ii) un promotor que se activa mediante el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se tiene que modular;

mediante lo cual tras la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión del gen de b) iii) .

37. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 36, en el que el ligando es un compuesto de la fórmula 5

en la que:

E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-C5) que contiene un carbono terciario;

R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH3Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, CºCH, 10 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2;

R2 es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH3CN, CN, CºCH, 1- propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, GOEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN o unido con R3 y los carbonos de fenilo a los cuales se unen R2 y R3 para formar un 15 etilenodioxi, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

R3 es H, Et o unido con R2 y los carbonos de fenilo a los cuales se unen R2 y R3 para formar un etilenodioxi, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo; 20

R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, Cl, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, CºCH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o SEt.

38. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 36, comprendiendo además introducir en la célula huésped un segundo ligando, en el que el segundo ligando es ácido 9-cis-retinoico o un análogo sintético de un ácido retinoico.

39. Un procedimiento para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de: 25

a) introducir en la célula huésped el sistema de modulación de la expresión génica de la reivindicación 12; y b) introducir en la célula huésped un ligando;

en el que el gen que se tiene que modular es un componente de un casete de expresión génica que comprende:

i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;

ii) un promotor que se activa mediante el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y 30

iii) un gen cuya expresión se tiene que modular;

mediante lo cual tras la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión del gen de b) iii) .

40. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39, en el que el ligando es un compuesto de la fórmula:

en la que E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-C5) que contiene un carbono terciario;

R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, CºCH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2; 5

R2 es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN. CºCH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe. SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr. SCN. SCHF2, SOMe, NH-CN, o unido con R3 y los carbonos de fenilo a los cuales están unidos R2 y R3 para formar un etilenodioxi, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente 10 a un carbono de fenilo;

R3 es H, Et, o unido con R2 y los carbonos de fenilo a los cuales están unidos R2 y R3 para formar un etilenodioxi, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, Cl, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, 15 C°CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o SEt.

41. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39, comprendiendo además introducir en la célula huésped un segundo ligando, en el que el segundo ligando es ácido 9-cis-retinoico o un análogo sintético de un ácido retinoico.

42. Una célula huésped aislada que comprende el sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 1. 20

43. La célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 42, en donde la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula animal y una célula de mamífero.

44. La célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 43, en donde la célula de mamífero es una célula murina o una célula humana. 25

45. Una célula huésped aislada que comprende el sistema de modulación de la expresión génica de acuerdo con la reivindicación 12.

46. La célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de levadura, una célula animal y una célula de mamífero. 30

47. La célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la célula de mamífero es una célula murina o una célula humana.

48. Un organismo no humano que comprende la célula huésped de la reivindicación 45.

49. El organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 48, en donde el organismo no humano se selecciona entre el grupo que consiste en una bacteria, un hongo, una levadura, un animal y un mamífero. 35

50. El organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 49, en donde el mamífero se selecciona entre el grupo que consiste en un ratón, una rata, un conejo, un gato, un perro, una vaca, una cabra, un cerdo, un caballo, una oveja, un mono y un chimpancé.

51. Un organismo no humano que comprende la célula huésped de la reivindicación 45.

52. El organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el organismo no humano se selecciona 40 entre el grupo que consiste en una bacteria, un hongo, una levadura, un animal y un mamífero.

53. El organismo no humano de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el mamífero se selecciona entre el grupo que consiste en un ratón, una rata, un conejo, un gato, un perro, una vaca, una cabra, un cerdo, un caballo, una oveja, un mono y un chimpancé.

54. El sistema de modulación de la expresión génica de la reivindicación 1, en el que dicho sistema muestra 45 sensibilidad de ligando aumentada en comparación con el sistema equivalente en el que se usa un dominio de unión a ligando de receptor X retinoico de lepidóptero, díptero o vertebrado.

55. El sistema de modulación de la expresión génica de la reivindicación 1, en el que dicho sistema muestra sensibilidad aumentada a ligandos no esteroideos en comparación con el sistema equivalente en el cual se usa un dominio de unión a ligando de receptor X retinoico de lepidóptero, díptero o vertebrado. 50

56. El sistema de modulación de la expresión génica de la reivindicación 12, en el que dicho sistema muestra sensibilidad de ligando aumentada en comparación con el sistema equivalente en el que se usa un dominio de unión a ligando de receptor X retinoico de lepidóptero, díptero o vertebrado.

57. El sistema de modulación de la expresión génica de la reivindicación 12, en el que dicho sistema muestra sensibilidad aumentada a ligandos no esteroideos en comparación con el sistema equivalente en el que se usa un dominio de unión a ligando de receptor X retinoico de lepidóptero, díptero o vertebrado.

Transactivación de Genes Indicadores a través de GAL4: CfEcRCDEF y Diversas Construcciones VP16: RXR/USP

en Células 3T3 mediante GS-E

Factor de activación

Concentración de GS-E (µM)

Figura 1

Transactivación de Genes Indicadores a través de GAL4: CfEcRDEF y Diversas Construcciones VP16: RXR/USP

en Células 3T3 mediante GS-E

Factor de activación

Concentración de GS-E (µM)

Figura 2

Análisis de Truncamientos de CfEcR con MmRXRDE en Células 3T3

ULR totales

Figura 4

Análisis de Truncamientos de CfEcRT con MmRXRDE en Células 3T3

ULR totales

Figura 5

Análisis de Truncamientos de CfEcR con LmUSPDE en Células 3T3

ULR totales

Figura 6

Análisis de Truncamientos de CfEcR con LmUSPE en Células 3T3

ULR totales

Figura 7

CfEcR- (C) DEF con compañeros diferentes

Unidades de luz totales

Figura 8

ULR totales

Figura 9

ULR totales

Figura 10

ULR totales

Análisis de Construcciones de LexACfEcR en Células 3T3

Figura 11

ULR totales

Figura 12

ULR totales

Concentración de GSE (uM)

Figura 13