RNA de interferencia útiles para la elaboración de medicamentos para el tratamiento o prevención de enfermedades humanas neurodegenerativas,

medicamentos así obtenidos y sus aplicaciones.

La presente invención describe inhibidores de la expresión génica del gen que codifica para la proteína NP1, que actúa como un inductor de apoptosis neural y neurodegeneración, útiles para la elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para el tratamiento o prevención de enfermedades humanas neurológicas, preferentemente enfermedades neurodegenerativas. Más preferentemente, la enfermedad neurodegenerativa es el Alzheimer. Estos inhibidores incluyen RNAi que actúan silenciando la expresión génica del gen NP1.

RNA de interferencia útiles para la elaboración de medicamentos para el tratamiento o prevención de enfermedades humanas neurodegenerativas, medicamentos así obtenidos y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

Métodos para la prevención y tratamiento de trastornos neurológicos incluyendo enfermedades neurodegenerativas, como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer y trastornos convulsivos.

Estado de la técnica

Evidencia previa sugiere que los mecanismos bioquímicos que causan la degeneración y muerte patológica de neuronas diferenciadas y maduras en diversos trastornos neurodegenerativos son los mismos que los que componen el programa intrínseco de suicidio celular o apoptosis una de cuyas funciones es inducir la síntesis "de novo" de proteínas letales para eliminar las células sobrantes durante el desarrollo del cerebro ^1-3.

En neuronas maduras está bien establecido que la reducción de la actividad neuronal pone en funcionamiento el programa intrínseco de muerte celular que provoca la síntesis "de novo" de proteínas letales que causan neurodegeneración apoptótica ⁴. Identificar cuáles son estas proteínas letales pro-apoptóticas que se sintetizan de nuevo antes de que las neuronas alcancen un punto irreversible del proceso de muerte ha sido la estrategia que ha guiado la investigación de nuestro laboratorio para obtener nuevas dianas para el desarrollo de tratamientos neuroprotectores.

Con este objetivo, se ha investigado la expresión génica durante la fase inicial del programa de muerte neuronal producido por reducción de la actividad sináptica. Mediante el uso de una técnica de análisis de expresión génica diferencial ⁵, se ha demostrado que la Pentraxina Neuronal 1 (NP1) es una proteína letal pro-apoptótica que se sintetiza en mayor cantidad cuando se reduce la actividad neuronal. Estudios previos indican que la NP1 forma parte del programa intrínseco de muerte y que contribuye a la neurodegeneración apoptótica que provoca la reducción de la actividad neuronal ⁶. Originalmente, la NP1 fue identificada y aislada como una proteína que se une de forma dependiente de calcio con taipoxina, una toxina de veneno de serpiente ⁷. El gen NP1 codifica una glicoproteína de una masa molecular aparente de aproximadamente 50 kDa, cuya secuencia de aminoácidos predice que es secretada. La expresión de NP1 se restringe al sistema nervioso ⁷.

La NP1 forma parte de la familia de proteínas Pentraxina, que recibe su nombre por su capacidad de formar pentámeros. Esta familia se compone de 8 proteínas que pueden subdividirse en dos clases estructurales de acuerdo a su tamaño; las centralitas cortas (aproa. 200 aminoácidos) y las largas (aproa. 400 aminoácidos) ⁸. Las pentraxinas cortas, identificadas hace ya tiempo en primer lugar, forman parte de la respuesta de fase aguda del sistema inmunitario innato e incluyen la proteína C-reactiva (CRP) y el componente amiloide P del suero (SAP). Las Pentraxinas largas, que han sido identificadas más recientemente, comparten con las cortas el dominio Pentraxina en el lado C-terminal, pero en su lado Amino-terminal son muy diferentes entre sí. Existen al menos tres Pentraxinas largas que se expresan en sistema nervioso: la Pentraxina Neuronal 1 (NP1), la pentraxina relacionada con actividad neuronal o Pentraxina Neuronal 2 (Narp o NP2) y el receptor de pentraxina neuronal (NPR) ^{7; 9-11}. Del estudio de las secuencias se predice que la NP1 y la NP2 son proteínas de secreción, mientras que NPR se identifica como una proteína transmembrana tipo II sin dominio intracelular ^{9; 12}. La función fisiológica de las pentraxinas neuronales no ha sido aun establecida. Sin embargo, en base a la homología que NP1 tiene con las pentraxinas más cortas como la proteína C-reactiva y la proteína P amiloide de suero, se propuso inicialmente que la función de la NP1 es la de captar material de desecho durante la remodelación de la sinapsis (Schlimgen et al., 1995; Omeis et al., 1996; Kirkpatrick et al., 2000). Por otro lado, estudios mas recientes del grupo de Paul Worley (J. Hopkins) han demostrado que Narp/NP2 tiene efectos sinaptogénicos y participa en fenómenos de remodelación sináptica ^{13; 14}.

Los estudios del grupo de Paul Worley and Richard Huganir han demostrado que la NP1 y la NP2 regulan el agrupamiento del subtipo AMPA de receptores de glutamato en sinapsis excitadoras, uniéndose a ellos en un dominio extracelular. La mitad amino terminal de la NP1 codifica varios dominios de espiral-enrollada (coiled-coil) que son esenciales para la multimerización de NP1 con ella misma o con otras proteínas ¹³. Además, la mitad carboxilo terminal de la NP1 codifica un dominio de lectina dependiente de calcio que reconoce oligosacáridos en glicoproteínas o glicolípidos. Hasta el momento se ha demostrado que la NP1 se une a los subtipos de receptores AMPA de glutamato ¹⁴, pero aún no se han identificado otras proteínas que interactúen con NP1, a excepción de NP2 y los receptores de AMPA. Hasta muy recientemente, tampoco se conocía ni la función, ni ninguna interacción, del receptor de pentraxinas NPR. Pero un estudio muy reciente ha demostrado que NPR tiene un dominio CROMO (dominio modificador de la organización de cromatina) que es un dominio de interacción con otras proteínas y ADN. En este estudio se demuestra que NPR a través de su dominio CROMO se une al dominio intracelular del receptor de tirosina fosfatasa PTPRO que está implicado en guía y crecimiento axonal ¹⁵. Este resultado permite considerar que los posibles efectos sobre neuritogénesis de la NP1 pueden estar mediados por una interacción con NPR y el receptor de tirosina fosfatasa PTPRO asociado a él.

Por otro lado, investigando la influencia de los diversos trayectos de señalización intracelulares que controlan la supervivencia y la muerte celular sobre la expresión de NP1 se ha demostrado que la sobreexpresión de NP1 durante el proceso de muerte apoptótica se induce por una fosforilación activadora de la actividad de la quinasa GSK3. Ni los trayectos de señalización implicados en muerte celular, como las proteínas quinasas activadas por estrés (SAP quinasas) c-jun N-terminal (JNK) o p38, ni el trayecto de señalización trófica PI3K/AKT activado por IGF, regulan la expresión de NP1¹⁶. El hallazgo de que la expresión de NP1 se regula por la quinasa GSK3 proporciona evidencia que indica que la degeneración neurítica inducida por NP1 comparte un mecanismo común con la neurodegeneración inducida por beta-amiloide. Varios estudios han demostrado que beta-amiloide provoca un incremento de la actividad de la quinasa GSK3¹⁷ y que GSK3 está incrementada en el cerebro con la enfermedad de Alzheimer (ver revisión en ¹⁸). Por otro lado, existe evidencia muy bien fundamentada de que el incremento de la actividad de la quinasa GSK3 produce retracción neurítica, mientras que la reducción de la actividad GSK3 produce sinaptogénesis ^19-22.

La mayoría de los procedimientos y técnicas de intervención terapéutica que hasta la fecha se dirigen a impedir el daño neuronal en los trastornos neurológicos tienen como objetivo el disminuir los estímulos tóxicos que causan el trastorno ²³. Por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer, existe gran cantidad de resultados que indican que los oligómeros solubles de la proteína beta-amiloide (Ab) son la causa de la pérdida de memoria, la demencia y la neurodegeneración que son las características típicas de la enfermedad ^24-26. En base a esta evidencia, la mayoría de las estrategias de tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer pretenden reducir la cantidad de proteína Ab, ya sea por modulación farmacológica de las secretasas de Ab o por inmunoterapia activa o pasiva para reducir la cantidad de oligómeros solubles de Ab ²³.

Hace ya tiempo que se ha postulado que la neurotoxicidad inducida por el péptido Ab es la responsable de las alteraciones sinápticas y la degeneración neuronal que se observa en la enfermedad de Alzheimer ²⁷. A pesar de que la hipótesis apoptótica de la degeneración neuronal en el cerebro de Alzheimer es un tema aún en debate ²⁶, varios análisis histológicos de cerebros de pacientes con la enfermedad han identificado neuronas con morfología apoptótica ²⁸. Además, diversos estudios han demostrado que el péptido Ab induce el programa de muerte apoptótica en cultivos primarios de neuronas... [Seguir leyendo]

1. RNA de interferencia (shRNAi) caracterizado porque el shRNAi se une preferentemente a la secuencia fragmento de RNAm de la proteína NP1 humana GCGGACCAACTACATGTAT (SEQ ID NO2) o a otro fragmento que comprenda a esta secuencia.

2. shRNAi según la reivindicación 1 caracterizado porque la proteína NP1 presenta la secuencia NPTX1_HUMAN, SwissProt primary accesión number Q15818 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

3. shRNAi según la reivindicación 1 caracterizado porque el shRNAi es un shRNAi expresado por la pareja de nucleótidos siguiente: 5'-gatcccc GCGGACCAACTACATGTAT ttcaagaga ATACATGTAGTTGGTCCGC ttttt-'3 (SEQ ID NO8, sentido) y la 5'-agctaaaaa GCGGACCAACTACATGTAT tctcttgaa ATACATGTAGTTGGTCCGC ggg-3' (SEQ ID NO9, antisentido).

4. shRNAi según la reivindicación 1 caracterizado porque el shRNAi es un shRNAi expresado por la pareja de nucleótidos siguiente: 5'-gatcccc GCGGACCAACTATATGTAT ttcaagaga ATACATATAGTTGGTCCGC ttttt-'3 (SEQ ID NO10, sentido), y la 5'-agctaaaaa GCGGACCAACTATATGTAT tctcttgaa ATACATATAGTTGGTCCGC ggg-3' (SEQ ID NO11, antisentido).

5. shRNAi según la reivindicación 1 caracterizado porque dicho shRNAi está comprendido en un vector de expresión o en un vector de transferencia.

6. shRNAi según la reivindicación 5 caracterizado porque el vector de expresión es un vector de expresión viral.

7. shRNAi según la reivindicación 6, donde el vector de expresión viral es un lentivirus.

8. shRNAi según la reivindicación 7 caracterizado porque el vector de expresión viral lentivirus es el vector pLVTHM-shRNAi-NP1 que comprende, al menos, una de las parejas de las secuencias siguientes: