Una célula huésped de hongo unicelular o pluricelular que es capaz de producir glicoproteínas que comprendenuna estructura central de N-glicano triantenaria,

en la que la célula huésped se modifica por ingeniería genética paraproducir glicoproteínas que tienen un N-glicano GlcNAc2Man3GlcNAc2 y en el que la célula huésped incluye ademásuna molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la N-acetilglucosaminiltransferasa V (GnT V) deratón (Δ145) fusionado a los aminoácidos 1-36 del péptido señal de dirección celular de MNN2 de S. cerevisiae, quedirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped.

Producción de glicoproteínas modificadas que tienen estructuras multiantenarias.

Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones mediante los cuales células huésped eucariotas no humanas, tales como células de hongos unicelulares y pluricelulares, pueden modificarse genéticamente para producir proteínas glicosiladas (glicoproteínas) que tienen patrones de glicosilación similares a los de glicoproteínas producidas por células animales, especialmente células humanas, que son útiles como agentes terapéuticos humanos o animales.

Antecedentes de la invención

Rutas de Glicosilación en Seres Humanos y Eucariotas Inferiores

Después de que el ADN se transcribe y se traduce en una proteína, el procesamiento post-traduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un proceso conocido como glicosilación. Diferentes organismos producen diferentes enzimas de glicosilación (glicosil transferasas y glicosidadasa) y tienen diferentes sustratos (azúcares de nucleótidos) disponibles, de forma que los patrones de glicosilación así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que se expresa la proteína particular: las bacterias normalmente no glicosilan las proteínas, y si lo hacen solamente es de una manera muy inespecífica (Moens and Vanderley den (1997) Arch Microbiol. 168 (3) : 169-175) . Los eucariotas inferiores tales como los hongos filamentosos y las levaduras añaden principalmente manosa y azúcares de manosil fosfato. El glicano resultante se conoce como un glicano del tipo de “alto contenido de manosa” o un manano. Las células vegetales y las células de insecto (tales como las células Sf9) glicosilan las proteínas de otra forma. Por el contrario, en eucariotas superiores tales como los seres humanos, la cadena lateral de oligosacárido naciente puede cortarse para retirar varios restos de manosa y alargarse con restos de azúcar adicionales que normalmente no se encuentran en los N-glicanos de los eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, Bretthauer, y col. (1999) Biotechnology and Applied Biochemistr y 30: 193-200; Martinet, y col. (1998) Biotechnology Letters 20:1171-1177; Weikert, y col. (1999) Nature Biotechnology, 17: 1116-1121; M. Malissard, y col. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications 267: 169-173; Jarvis, y col., (1998) Current Opinion in Biotechnology 9: 528-533; and Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9: S29-S35.

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo de mamífero comienza con una serie de reacciones secuenciales en cuyo transcurso se añaden restos de azúcar y se retiran mientras que la proteína se desplaza a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glicosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glicosilación resultantes de las proteínas secretadas. De esta manera, el patrón de glicosilación resultante de proteínas expresadas huésped y eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glicosilación de las proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999) . La estructura de un N-glicano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las primeras etapas de glicosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 se ensamblan por una serie secuencial de reacciones en la membrana del retículo endoplástico (ER) (Figura 13) e (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el doliquil pirofosfato de anclaje de lípidos a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica se define por un resto de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr (SEC ID Nº: 1 y 2) en la que Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne (1990) Protein Eng. 3: 433-42) . El procesamiento adicional por glucosidasas y manosidasas se produce en el RE antes de que la glicoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi en sus primeras fases, en el que los restos de manosa adicionales se retiran por alfa (α) -1, 2-manosidasas específicas de Golgi. El procesamiento continúa según avanza la proteína a través del aparato de Golgi. En el aparato de Golgi medio, varias enzimas de modificación, incluyendo N-acetilglucosaminil transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV) , manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y retiran restos de azúcar específicos. Finalmente, en el trans-Golgi, las galactosiltransferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) producen una estructura de glicoproteína que se libera del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri-y tetra-antenarias, que contienen galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un alto grado de ácido siálico terminal, la que proporciona a las glicoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glicano humano típico se muestra en la Figura 1B. Véanse también en las Figuras 14 y 15 etapas implicadas en el procesamiento de N-glicano de tipo de mamífero.

En todos los eucariotas estudiados hasta la fecha, las glicoproteínas proceden de un precursor de oligosacárido unido a lípidos común Glc3Man9GlcNAc2-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplásmico, la síntesis y el procesamiento de los oligosacáridos unidos a dolicol pirofosfato son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido central por células fúngicas, por ejemplo, levadura, difiere significativamente de los humanos según se desplaza a lo largo de la ruta de secreción.

En levaduras, estas etapas se catalizan por manosil transferasas que residen en el aparato de Golgi, tales como Och1p, Mnt1p y Mnn1p, que añaden secuencialmente azúcares de manosa al oligosacárido central. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas de tipo humano y, por lo tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosil transferasa. Se ha mostrado que mutantes de S. cerevisiae, deficientes en la actividad manosiltransferasa (por ejemplo mutantes och1 o mn9) son no letales y presentan un contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura. También puede que tener que eliminarse otras enzimas de procesamiento de oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasas, dependiendo de las rutas de glicosilación particulares del huésped.

Precursores de Nucleótidos de Azúcar

Los N-glicanos de las glicoproteínas animales normalmente incluyen galactosa, fucosa y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentran en las glicoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, la serie completa de precursores de azúcar de nucleótidos (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-ácido N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se transportan al interior del aparato de Golgi, donde se unen al oligosacárido central por glicosiltransferasas (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol. 91 (2) : A406-A405; Sommers y Hirschberg (1982) J. Biol. Chem. 257 (18) : 811-817; Perez y Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138: 709-715) .

Las reacciones de transferencia de glicosilo normalmente producen un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Aunque los monofosfatos pueden exportarse directamente en el intercambio por azúcares de nucleósido trifosfato por un mecanismo de antiporte, los difosfonucleósidos (por ejemplo GDP) tienen que escindirse por fosfatasas (por ejemplo GDPasa) para producir nucleósido monofosfatos y fosfato inorgánico antes de exportarse. Esta reacción es importante para una glicosilación eficaz, por ejemplo, se ha descubierto que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo esta GDPasa tiene una actividad reducida en un 90 % hacia UDP (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269 (1) : 207-211) . Los eucariotas inferiores normalmente carecen de una actividad difosfatasa específica de UDP en el aparato de Golgi ya que no usan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteínas basada en el aparato de Golgi. Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha descubierto que añade restos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (procedentes de UDP-galactosa) se ha descubierto que tiene una actividad UDPasa específica, lo que indica el posible requisito de dicha enzima (Beminsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269 (1) : 207-211) . Se sabe... [Seguir leyendo]

1. Una célula huésped de hongo unicelular o pluricelular que es capaz de producir glicoproteínas que comprenden una estructura central de N-glicano triantenaria, en la que la célula huésped se modifica por ingeniería genética para producir glicoproteínas que tienen un N-glicano GlcNAc2Man3GlcNAc2 y en el que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la N-acetilglucosaminiltransferasa V (GnT V) de ratón (∆145) fusionado a los aminoácidos 1-36 del péptido señal de dirección celular de MNN2 de S. cerevisiae, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped.

2. La célula huésped de la reivindicación 1, en la que las estructuras triantenarias producidas en dicha célula huésped comprenden una N-acetilglucosamina añadida al núcleo de alfa 1, 6 manosilo en un enlace beta 1, 6.

3. La célula huésped de hongo unicelular o pluricelular de la reivindicación 1 ó 2, en la que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa IV (GnT IV) exógena fusionado a un péptido señal de dirección celular normalmente no asociado con el dominio catalítico, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped para producir una glicoproteína que tiene una estructura central de N-glicano tetraantenario.

4. La célula huésped de hongo unicelular o pluricelular de la reivindicación 1 a 3, en la que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa IX (GnT IX) exógena fusionado a un péptido señal de dirección celular normalmente no asociado con el dominio catalítico, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped para producir una glicoproteína que tiene una estructura central de N-glicano tetraantenario.

5. La célula huésped de la reivindicación 3 ó 4, en la que dichas estructuras tetraantenarias producidas por dicha célula huésped comprenden estructuras de GlcNAc4Man3GlcNAc2 que son capaces de experimentar reacciones adicionales por la N-acetilglucosaminiltransferasa VI (GnT VI) .

6. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha célula huésped comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima que tiene actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III) .

7. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha célula huésped es deficiente en una actividad OCH1 manosiltransferasa y/o actividad Dol-P-Man:MansGlcNAc2-PP-Dol manosiltransferasa.

8. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha célula huésped se modifica por ingeniería genética adicionalmente para expresar mayores niveles de actividad del transportador de UDP-GlcNAc para aumentar los niveles de UDP-GlcNAc en la célula.

9. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minutia, Ogataea minuta, Pichia lindneri, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae, Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

10. La célula huésped de la reivindicación 9, en la que la célula huésped es Pichia pastoris.

11. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la glicoproteína es una proteína terapéutica.

12. La célula huésped de la reivindicación 11, en la que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo que consiste en dominios kringle de plasminógeno humano, eritropoyetina, citocinas, factores de coagulación, cadena a del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de urea tripsina, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor-2 de crecimiento del endotelio vascular, factor-1 inhibidor de progenitor de mieloides, osteoprotegerina, antitripsina α-1, DNasa II, α-feto proteínas, AAT, rhTBP-I (proteína 1 de unión a TNF) , TACI-Ig (activador transmembrana y modulador de calcio y elemento de interacción de ligando de ciclofilina) , FSH (hormona estimuladora del folículo) , GM-CSF, GLP-1 con o sin FC (proteína 1 similar a glucagón) , antagonista del receptor de IL-1, sTNRr (fusión Fc del receptor de TNF soluble) , ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4-Ig) .

13. Un procedimiento para producir una glicoproteína que comprende expresar un ácido nucleico que codifica la glicoproteína en una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha glicoproteína comprende N-glicanos que tienen estructuras triantenarias.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha glicoproteína comprende N-glicanos que tienen estructuras tetraantenarias.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha glicoproteína comprende además un resto de GlcNAc biseccionado.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha glicoproteína carece de fucosa.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que dicha glicoproteína se selecciona entre el grupo que consiste en dominios kringle de plasminógeno humano, eritropoyetina, citocinas, factores de coagulación, cadena a del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de urea tripsina, proteína de unión IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor-2 de crecimiento del endotelio vascular, factor-1 inhibidor de progenitor de mieloide, osteoprotegerina, antitripsina α-1, DNasa II, α-feto proteínas, AAT, rhTBPI (proteína 1 de unión a TNF) , TACI-Ig (activador transmembrana y modulador de calcio y elemento de interacción de ligando de ciclofilina) , FSH (hormona estimuladora del folículo) , GM-CSF, GLP-1 con o sin FC (proteína 1 similar al glucagón) , agonista del receptor de IL-1, sTNRr (fusión Fc del receptor de TNF soluble) , ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-Ig (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4-Ig) .

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, que comprende además la etapa de aislar la glicoproteína a partir del huésped.

20. Una composición farmacéutica que comprende una composición de glicoproteína producida por una cualquiera de las células huésped de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dichas glicoproteínas dentro de dicha composición carecen de fucosa y en la que más de un 50 % en moles de las estructuras centrales de N-glicano de las glicoproteínas en dicha composición tienen estructuras triantenarias.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en la que dichas estructuras triantenarias comprenden al menos tres GlcNAc en un oligosacárido de Man3GlcNAc2.

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 20 ó 21, en la que algunas o todas las estructuras triantenarias comprenden una N-acetilglucosamina añadida al núcleo alfa 1, 6 manosilo en un enlace beta 1, 6 en la ramificación del oligosacárido.

23. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en la que más de un 50 % en moles

o más de un 75 % en moles de las estructuras centrales de N-glicano están modificadas adicionalmente por GnT IV.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en la que algunas o todas las estructuras modificadas por GnT IV comprenden la ramificación de oligosacárido GlcNAc β1, 6 GlcNAc β 1, 2 -Manal, 6 (GlcNAc β1, 4 GlcNAc β1, 2 Manal, 3) Man β1, 4 -GlcNAc β 1, 4 -GlcNAcβ1, 4 -Asn.

25. Un vector capaz de expresar en una célula huésped de hongo unicelular o pluricelular una enzima que tiene actividad N-acetilglucosaminiltransferasa V (GnT V) que es sustancialmente intracelular, en el que dicha enzima comprende el dominio catalítico de GnT V de ratón (∆145) fusionado a los aminoácidos 1-36 del péptido señal de dirección celular MNN2 de S. cerevisiae, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de dicha célula huésped.

IINICIANDO ACTIVIDAD

Marco de lectura abierto de alfa-1, 2-manosidasa IA de M. musculus. Los dominios transmembrana y catalítico están destacados en negrita respectivamente. La secuencia de los cebadores usados para generar los truncamientos N-terminales están subrayados y el principio de cada fragmento de proteína respectivo se indica con una flecha ILeyendas:

Figura 41

Manosil (alfa-1, 3-) -glicoprotein beta-1, 4-N-acetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima A (MGAT4A) Número de acceso NM_012214.

Manosil (alfa-1, 3-) -glicoprotein beta-1, 4-N-acetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima A (MGAT4A) , ARNm

Figura 41 (Cont.)

Figura 42

Manosil (alfa-1, 3-) -glicoprotein beta-1, 4-N-acetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima B (MGAT4B) Número de acceso NM_014275.

Manosil (alfa-1, 3-) glicoprotein beta-1, 4-N-acetilglucosaminiltransferasa de Homo sapiens, isoenzima B (MGAT4B) , ARNm

Figura 44 (Cont.)

Figura 43

N-acetilglucosaminiltransferasa V de Mus musculus (Mgat5) Número de acceso AF474154.

N-acetilglucosaminiltransferasa V de Mus musculus (Mgat5) , ARNm

Figura 43 (Cont.)

Figura 44

N-acetilglucosaminiltransferasa VI de Gallus gallus, GnT-VI; número de acceso AB040608

ARNm de GnT-VI de Gallus gallus para N-acetilglucosaminiltransferasa VI, cds completo Figura 44 (Cont.)

Figura 45

GnT-XI, N-acetilglucosaminiltransferasa IX de Homo sapiens (GnT IX)

ARNm de GnT-IX de Homo sapiens para N-acetilglucosaminiltransferasa IX, cds completo; número de acceso AB109185.1

Figura 46 Figura 46 (Cont.)