Biblioteca de ADN combinatoria para producir N-glucanos modificados en eucariotas inferiores.

Un procedimiento para producir una glucoproteína de tipo humano en una célula huésped que es un hongo unicelular o filamentoso que no presenta actividad α

1, 6 manosiltransferasa con respecto al N-glucano en una glucoproteína, comprendiendo el procedimiento la etapa de introducir en la célula huésped un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende el dominio catalítico de una α-1, 2-manosidasa fusionada en el extremo N-terminal con un péptido señal de dirección celular SEC12, VAN1, o MNN10 para la producción de una estructura de carbohidrato de Man5GlcNAc2, en el que Man5GlcNAc2 se produce como un sustrato productivo para GnTI in vivo dentro de la célula huésped a un rendimiento de al menos 30 por ciento en moles.

Biblioteca de ADN combinatoria para producir N-glucanos modificados en eucariotas inferiores

Declaración con respecto a la investigación patrocinada federalmente

La presente invención se financió, al menos en parte, con una subvención estatal de los Institutitos Nacionales de la Salud (Subvención de NIH de Fase I nº 1R43GM66690-1) y una subvención del departamento de comercio, Número de Acuerdo de Cooperación de NIST-ATP 70NANB2H3046. Por lo tanto, el gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la presente invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones por los que pueden modificarse genéticamente células huésped eucariotas no humanas, tales como hongos u otras células eucariotas, para producir proteínas glucosiladas (glucoproteínas) que tienen patrones de glucosilación similares a los de glucoproteínas producidas por células animales, especialmente células humanas, que son útiles como agentes terapéuticos humanos o animales.

Antecedentes de la invención

Rutas de Glucosilación en Humanos y Eucariotas Inferiores

Después de que el ADN se transcriba y traduzca en una proteína, el procesamiento postraduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un proceso conocido como glucosilación. Diferentes organismos producen diferentes enzimas de glucosilación (glucosiltransferasas y glucosidasas) y tienen diferentes sustratos (nucleótidosazúcar) disponibles, de modo que los patrones de glucosilación así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que se exprese la proteína particular. Las bacterias típicamente no glucosilan proteínas y si lo hacen es solamente de una manera muy inespecífica (Moens y Vanderley den, 1997 Arch Microbiol. 168 (3) :169-175) . Los eucariotas inferiores tales como hongos filamentosos y levaduras añaden principalmente manosa y azúcares de manosilfosfato. El glucano resultante se conoce como un glucano del tipo de “alto contenido de manosa” o un manano. Las células vegetales y células de insecto (tales como células Sf9) glucosilan proteínas de otra manera más. Por el contrario, en eucariotas superiores tales como seres humanos, la cadena lateral de oligosacárido naciente puede reducirse para retirar varios restos de manosa y alargarse con restos de azúcar adicionales que típicamente no se encuentran en los Nglucanos de eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, R.K. Bretthauer, y col. Biotechnology and Applied Biochemistr y , 1999, 30, 193-200; W. Martinet, y col. Biotechnology Letters, 1998, 20, 1171-1177; S. Weikert, y col. Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; M. Malissard, y col. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267, 169-173; Jarvis, y col., Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9:528-533; y M. Takeuchi, 1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9, S29-S35.

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones secuenciales en el transcurso de las que se añaden y retiran restos de azúcar mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glucosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glucosilación resultantes de proteínas secretadas. Por lo tanto, el patrón de glucosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glucosilación de proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999) . La estructura de un N-glucano fúngico típico se muestra en la

Figura 1A.

Las primeras etapas de la glucosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 unidos a lípidos se ensamblan por un conjunto secuencial de reacciones en la membrana del retículo endoplásmico (RE) y (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el doliquil pirofosfato del anclaje lipídico a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica se define por un resto de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr en la que Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel, 1990) . Se produce un procesamiento adicional por glucosidasas y manosidasas en el RE antes de que la glucoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, en el que se retiran restos de manosa adicionales por alfa (α) -1, 2-manosidasas específicas de Golgi. El procesamiento continúa a medida que la proteína avanza a través del Golgi. En el Golgi medio, varias enzimas modificadoras, incluyendo N-acetilglucosaminil Transferasas (GnTI, GnTII, CmTIII, GnTIV y GnTV) , manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y retiran restos de azúcar específicos. Finalmente, en el trans-Golgi, las galactosiltransferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) producen una estructura glucoproteica que se libera del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri- y tetraantenarias, que contienen galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un alto grado de ácido siálico terminal, la que proporciona a la glucoproteína sus características humanas. La estructura de un N-glucano humano típico se muestra en la Figura 1B.

En casi todos los eucariotas, las glucoproteínas derivan de un precursor oligosacárido unido a lípido común Glc3Man9GlcNAc2-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplásmico, la síntesis y el procesamiento de oligosacáridos unidos a dolicol pirofosfato son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el

procesamiento adicional del oligosacárido central por células fúngicas, por ejemplo, levadura, una vez que se ha transferido a un péptido que deja el RE y entra en el Golgi, difiere significativamente de los seres humanos a medida que se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares de manosa.

En levadura, estas etapas se catalizan por manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Och1p, Mnt1p y Mnn1p, que añaden secuencialmente azúcares de manosa al oligosacárido central. La estructura resultante no es deseable para la producción de proteínas de tipo humano y, por lo tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Se ha mostrado que los mutantes de S. cerevisiae, deficientes en actividad manosiltransferasa (por ejemplo, mutantes och1 o mnn9) no son letales y presentan un contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glucoproteínas de levadura. Otras enzimas de procesamiento de oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasa, también pueden tener que eliminarse dependiendo del patrón de glucosilación endógeno particular del huésped.

Precursores de Nucleótidos de Azúcares

Los N-glucanos de glucoproteínas animales típicamente incluyen galactosa, fucosa y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentran en glucoproteínas producidas en levadura y hongos filamentosos. En seres humanos, se sintetiza la serie completa de precursores de nucleótidos-azúcar (por ejemplo UDP-N-acetilglucosamina; UDP-Nacetilgalactosamina, CMP-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) en el citosol y se transportan al Golgi, en el que se unen al oligosacárido central por glucosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg, 1981 J. Cell Biol. 91 (2) : A406-A406; Sommers y Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257 (18) : 811-817; Perez y Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138: 709-715) .

Las reacciones de transferencia de glucosilo típicamente producen un producto secundario que es un nucleósido difosfato o un monofosfato. Aunque los monofosfatos pueden exportarse directamente en intercambio con azúcares de nucleósido trifosfatos por un mecanismo antiportador, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) tienen que escindirse por fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir nucleósido monofosfatos y fosfato inorgánico antes de exportarse. Esta reacción es importante para una glucosilación eficaz; por ejemplo, se ha descubierto que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para manosilación. Sin embargo, esa GDPasa tiene actividad reducida en un 90% para UDP (Berninsone y col., 1994 J. Biol. Chem. 269 (1) : 207-211) .

Los eucariotas inferiores típicamente carecen de actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi puesto que no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glucoproteínas basada en el Golgi. Se ha descubierto que Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha descubierto que añade restos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (procedentes... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una glucoproteína de tipo humano en una célula huésped que es un hongo unicelular o filamentoso que no presenta actividad α1, 6 manosiltransferasa con respecto al N-glucano en una glucoproteína, comprendiendo el procedimiento la etapa de introducir en la célula huésped un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende el dominio catalítico de una α-1, 2-manosidasa fusionada en el extremo N-terminal con un péptido señal de dirección celular SEC12, VAN1, o MNN10 para la producción de una estructura de carbohidrato de Man5GlcNAc2, en el que Man5GlcNAc2 se produce como un sustrato productivo para GnTI in vivo dentro de la célula huésped a un rendimiento de al menos 30 por ciento en moles.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la α-1, 2-manosidasa está seleccionada para tener actividad óptima al pH de la localización en la célula huésped en la que se produce la estructura de carbohidrato.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la α-1, 2-manosidasa está seleccionada para tener un pH óptimo dentro de 1, 4 unidades de pH del pH medio óptimo de otras enzimas representativas en el orgánulo en el que se localiza la enzima.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la α-1, 2-manosidasa está dirigida a una localización subcelular en la célula huésped en la que la enzima tendrá actividad óptima.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la glucoproteína comprende N-glucanos de los que más de 30 por ciento en moles comprende seis o menos restos de manosa.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la glucoproteína comprende N-glucanos de los que más del 30 por ciento en moles comprende tres o menos restos de manosa.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la glucoproteína comprende uno o más azúcares seleccionados del grupo que consiste en GlcNAc, galactosa, ácido siálico y fucosa.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la glucoproteína comprende al menos una rama de oligosacáridos que comprende la estructura NeuNAcGalGlcNAcMan.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la célula huésped está seleccionada del grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae, Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el huésped es deficiente en la actividad de una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en manosiltransferasas y fosfomanosiltransferasas.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el huésped no expresa una enzima seleccionada del grupo que consiste en 1, 6 manosiltransferasa; 1, 3 manosiltransferasa; y 1, 2 manosiltransferasa.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el huésped es un mutante ochl de P. pastoris.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el huésped expresa actividades transportadoras de GnTI y UDP-GlcNAc.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el huésped expresa una actividad difosfatasa específica de UDP o GDP.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de aislar la glucoproteína del huésped.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende adicionalmente la etapa de someter la glucoproteína aislada al menos a una reacción de glucosilación adicional in vitro, posterior a su aislamiento del huésped.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la α-1, 2-manosidasa codificada tiene actividad óptima a un pH de entre aproximadamente 5, 1 y aproximadamente 8, 0.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la manosidasa tiene actividad óptima a un pH de entre aproximadamente 5, 5 y aproximadamente 7, 5.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la actividad α-1, 2-manosidasa procede de ratón, ser humano, Lepidoptera, Aspergillus nidulans o Bacillus sp., C. elegans, D. melanogaster, P. citrinum o X. laevis.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la célula huésped incluye adicionalmente un ácido nucleico que codifica un dominio catalítico que codifica una actividad glucosidasa, manosidasa o glucosiltransferasa derivada de un miembro del grupo que consiste en GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnT V, GnT VI, GalT, Fucosiltransferasa y Sialiltransferasa, y en el que el dominio catalítico tiene un pH óptimo dentro de 1, 4 unidades de

pH del pH óptimo medio de otras enzimas representativas en el orgánulo en el que se localiza la enzima, o tiene actividad óptima a un pH entre 5, 1 y 8, 0.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la manosidasa está seleccionada del grupo que consiste en manosidasa IA de C. elegans, manosidasa IB de C. elegans, manosidasa IA de D. melanogaster, manosidasa IB de H. sapiens, manosidasa I de P. citrinum, manosidasa IA de ratón, manosidasa IB de ratón,

manosidasa IA de A. nidulans, manosidasa IB de A. nidulans, manosidasa IC de A. nidulans, manosidasa II de ratón, manosidasa II de C. elegans, manosidasa II de H. sapiens, y manosidasa III.

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la molécula de ácido nucleico codifica una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en UDP-GlcNAc transferasa, UDP-galactosiltransferasa, GDPfucosiltransferasa, CMP-sialiltransferasa, transportador de UP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa,

transportador de GDP-fucosa, transportador de CMP-ácido siálico y nucleótido difosfatasas.

23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el huésped expresa actividades transportadoras de GnTI y UDP-GlcNAc.

24. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el huésped expresa una actividad difosfatasa específica de UDP o GDP.