Expresión de manosidasa de clase 2 y manosidasa de clase III en células eucariotas inferiores.

Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped,

un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende

(a) un dominio catalítico de manosidasa III capaz de hidrolizar un sustrato oligosacarídico que comprende un enlace glicosídico Man1,3 y/o un enlace glicosídico Man1,6; fusionado a

(b) un péptido señal de dirección celular normalmente no asociado con el dominio catatítico de (a), en el que dicho péptido señal de dirección celular dirige dicho dominio catalítico de manosidasa exógeno a la ruta secretora de la célula huésped,

en el que dicha enzima quimérica es capaz de hidrolizar in vivo más del 10% de los enlaces Man -1,3 y/o Man - 1,6 de un sustrato que comprende un enlace glicosídico Man1,3 y/o un enlace glicosídico Man1,6.

Expresión de manosidasa de clase 2 y manosidasa de clase III en células eucariotas inferiores.

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de glicosilación de proteínas en levaduras u hongos filamentosos unicelulares o multicelulares, específicamente la introducción de una enzima manosidasa que tiene especificidad de sustrato para hidrólisis de enlaces glucosídicos Man 1, 3 y/o Man 1, 6. La presente invención se refiere además a células huésped novedosas que comprenden genes que codifican una enzima manosidasa y N-glicano o intermedios que contienen N-glicano producidos como resultado de la hidrólisis.

Antecedentes de la invención

Rutas de Glicosilación en Seres Humanos y Eucariotas Inferiores Después de que el ADN se transcribe y se traduce en una proteína, el procesamiento post-traduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un procedimiento conocido como glicosilación. Organismos diferentes producen enzimas de glicosilación diferentes, (glicosiltransferasas y glicosidasas) , y tienen sustratos diferentes (azúcares nucleótidicos) disponibles, de forma que los patrones de glicosilación, así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que la proteína particular se esté expresando. Las bacterias típicamente no glicosilan las proteínas y, si lo hacen, sólo de una manera muy inespecífica (Moens y Vanderley den, 1997 Arch Microbiol. 168 (3) : 169-175) . Los eucariotas inferiores, tales como hongos filamentosos y levaduras añaden principalmente los azúcares manosa y manosil fosfato. El glicano resultante se conoce como un glicano o un manano de tipo "de alto contenido en manosa". Las células vegetales y células de insecto (tales como las células Sf9) glicosilan las proteínas de otra manera. Por el contrario, en eucariotas superiores tales como seres humanos, la cadena lateral de oligosacáridos naciente se puede cortar para retirar varios restos de manosa y alargar con restos de azúcar adicionales que típicamente no se encuentran en N-glicanos de eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, R.K. Bretthauer, y col. Biotechnology and Applied Biochemistr y , 1999, 30, 193-200; W. Martinet, y col. Biotechnology Letters, 1998, 20, 1171-1177; Weikert S., y col. , Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; Malissard M., y col. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267, 169-173; Jarvis, y col., Current Opinion in Biotechnology, 1998,

9: 528-533; y M. Takeuchi, 1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9, S29-S35 .

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones en secuencia durante el transcurso de las cuales se añaden y se retiran restos de azúcares mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glicosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glicosilación resultantes de proteínas secretadas. Por tanto, el patrón de glicosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glicosilación de proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999) . La estructura de un N-glicano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las etapas tempranas de glicosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 enlazados a lípidos se ensamblan mediante un conjunto de reacciones en secuencia en la membrana del retículo endoplasmático (RE) y (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el pirofosfato de dolicilo anclado a lípido a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica está definido por un resto de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr donde Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne, 1990 Protein Eng. 3: 433-42) . El procesamiento adicional mediante glicosidasas y manosidasas ocurre en el RE antes de que la glicoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, donde los restos de manosa adicionales se retiran mediante alfa manosidasas ( -1, 2-) específicas de Golgi. El procesamiento continúa a medida que la proteína avanza a través del Golgi. En el Golgi medio, varias enzimas modificadoras, incluyendo N-acetilglucosaminil Transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV) , manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y retiran restos de azúcares específicos. Finalmente, en el Golgi trans, las galactosiltranferasas (GalT) y Sialiltransferasas (ST) producen una estructura de la glicoproteína que se libera a partir del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri- y tetra-antenarias, que contiene galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un ácido siálico terminal de grado elevado, que proporciona a las glicoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glicano humano típico se muestra en la Figura 1B.

En casi todos los eucariotas, las glicoproteínas se obtienen a partir de un precursor oligosacárido enlazado a lípido común Glc3Man9GlcNAc2-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplasmático, la síntesis y procesamiento de oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolicol son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido de núcleo mediante células fúngicas, por ejemplo, levaduras, una vez que se ha transferido a un péptido que deja el RE y entra en el Golgi, difiere significativamente del de humanos ya que se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares manosa.

En levadura, estas etapas están catalizadas por las manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Och1p, Mnt1p y Mnn1p, que añaden secuencialmente azúcares manosa al oligosacárido de núcleo. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas de tipo humano y, por tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Los mutantes de S. cerevisiae, que carecen de actividad manosil-transferasa (por ejemplo, mutantes de och1 o mnn19) han demostrado ser no mortales y presentan contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura, pareciéndose más, por tanto, a oligosacáridos de eucariotas superiores.

Precursores de Nucleótidos de Azúcar

Los N-glicanos de glicoproteínas animales típicamente incluyen galactosa, fucosa, y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentran en glicoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, el intervalo completo de precursores de azúcares nucleotídicos (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-Nacetilgalactosamina, ácido CMP-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen al oligosacárido de núcleo mediante glicosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg, J. Cell Biol 1981. 91 (2) : A406-A406; Sommers y Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257 (18) : 811-817; Pérez y Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138:709 -- 715) .

Las reacciones de transferencia de glicosilo típicamente producen un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Mientras los monofosfatos se pueden exportar directamente como intercambio por azúcares trifosfato de nucleósido mediante un mecanismo de antiportador, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir monofosfatos de nucleósidos y fosfato inorgánico antes de exportarse. Esta reacción es importante para la glicosilación eficaz; por ejemplo, se ha observado que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo, que GDPasa tiene una actividad reducida en el 90% hacia UDP (Berninsone y col., 1994 J. Biol. Chem. 269 (1) : 207-211) . Los eucariotas inferiores típicamente carecen de actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi, ya que los mismos no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteína basada en Golgi. Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha observado que añade restos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (a partir de UDP-galactosa) se ha observado que tiene actividad de UDPasa específica, indicando el requerimiento potencial de una enzima de este tipo (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. . 269 (1) : 207-211) . Se conoce que UDP es un inhibidor potente de glicosiltransferasas y la remoción de este producto secundario de la glicosilación puede ser importante para evitar la inhibición de glicosil-transferasa en el lumen... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped, un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende (a) un dominio catalítico de manosidasa III capaz de hidrolizar un sustrato oligosacarídico que comprende un enlace glicosídico Man 1, 3 y/o un enlace glicosídico Man 1, 6; fusionado a (b) un péptido señal de dirección celular normalmente no asociado con el dominio catatítico de (a) , en el que dicho péptido señal de dirección celular dirige dicho dominio catalítico de manosidasa exógeno a la ruta secretora de la célula huésped, en el que dicha enzima quimérica es capaz de hidrolizar in vivo más del 10% de los enlaces Man -1, 3 y/o Man 1, 6 de un sustrato que comprende un enlace glicosídico Man 1, 3 y/o un enlace glicosídico Man 1, 6.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido señal de dirección celular, se selecciona entre el grupo que consiste en: GLS 1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de Pichia, MNN9 de Saccharomyces, VAN1 de Saccharomyces, ANP1 de Saccharomyces, HOC1 de Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNN11 de Saccharomyces, MNT1 de Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3 de Pichia, KTR1 de Saccharomyces, KTR2 de Saccharomyces, GnTI de Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YUR1 de Saccharomyces, MNN1 de Saccharomyces y MNN6 de Saccharomyces.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio catalítico de manosidasa III es el dominio catalítico de manosidasa III de Sf9.

4. El procedimiento de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula huésped expresa al menos una

actividad enzimática seleccionada entre el grupo que consiste en -1, 2-manosidasa, transportador UDP-GlcNAc, N-acetilglucosaminiltransferasas (GnT) , galactosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST) .

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína comprende Nglicanos que comprenden Man3GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa III está sobreexpresada.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa III tiene un pH óptimo de aproximadamente 5, 0 a aproximadamente 8, 0.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa III está localizado dentro de al menos uno del RE, aparato de Golgi o la red de Golgi trans de la célula huésped.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa 3 está codificado por un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio catalítico de manosidasa nativo para la célula huésped.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa III está codificado por un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio catalítico de manosidasa heterólogo a la célula huésped.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa III es una manosidasa III de células de insecto.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el dominio catalítico de manosidasa III es el dominio catalítico de manosidasa III de Sf9.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima quimérica se expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un péptido de dirección celular nativo para la célula huésped.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima quimérica se expresa a partir de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un péptido de dirección celular heterólogo para el dominio catalítico de manosidasa.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo además la etapa de aislar la glicoproteína a partir de la célula huésped.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae, Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

19. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la célula huésped es Pichia pastoris.

20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína es una proteína terapéutica.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo que consiste en eritropoyetina, citoquinas, factores de coagulación, cadena de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa, inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IGF,

transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina) , FSH, (hormona estimulante de folículos) , GM-CSF, GLP-1, con y sin FC, (proteína similar a glucagón 1) , agonista del receptor de IL-1, sTNFr, (enbrel o fusión Fc de receptor de TNF soluble) , ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-lg, (lg Antígeno 4 asociado con Linfocitos T Citotóxicos) .

22. Una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende al menos dos construcciones genéticas diferentes para expresión en una célula huésped de hongo filamentoso unicelular o pluricelular, en la que al menos una construcción genética comprende un fragmento de ácido nucleico que codifica un dominio catalítico de manosidasa III ligado en fase con un fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido señal de dirección celular que no está normalmente asociado con el dominio catalítico, en el que dicho péptido señal de dirección celular dirige dicho dominio catalítico de manosidasa III a la ruta secretora de la célula huésped.

23. La biblioteca de la reivindicación 22, en la que el dominio catalítico de manosidasa es una manosidasa III de células de insecto.

24. La biblioteca de la reivindicación 22, en la que el dominio catalítico de manosidasa III es el dominio catalítico de manosidasa III de Sf9.

25. La biblioteca de la reivindicación 22, en la que el fragmento de de acido nucleico que codifica un péptido de dirección celular, se selecciona entre el grupo que consiste en: GLS 1 de Saccharomyces, MNS1 de Saccharomyces, SEC12 de Saccharomyces, SEC de Pichia, OCH1 de Pichia, MNN9 de Saccharomyces, VAN1 de Saccharomyces, ANP1 de Saccharomyces, HOC1 de Saccharomyces, MNN10 de Saccharomyces, MNN11 de Saccharomyces, MNT1 de Saccharomyces, D2 de Pichia, D9 de Pichia, J3 de Pichia, KTR1 de Saccharomyces, KTR2 de Saccharomyces, GnTI de Kluyveromyces, MNN2 de Saccharomyces, MNN5 de Saccharomyces, YUR1 de Saccharomyces, MNN1 de Saccharomyces y MNN6 de Saccharomyces.

26. Una enzima quimérica que comprende un dominio catalítico de manosidasa III condensado en fase a un péptido de dirección celular que no está normalmente asociado con dicho dominio catalítico y dirige la enzima quimérica a la ruta secretora de la célula huésped, en la que, tras expresión en una levadura o célula huésped de hongo filamentoso unicelular o pluricelular, dicho polipéptido quimérico es capaz de hidrolizar in vivo un sustrato oligosacarídico que comprende uno o dos enlaces glicosídicos Man 1, 3 y Man 1, 6 en la medida en que al menos el 10 % de los enlaces Man 1, 3 y/o Man 1, 6 del sustrato se hidrolizan in vivo.

27. Un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica de la reivindicación 26.

28. Una célula huésped de hongo filamentoso unicelular o pluricelular que comprende una enzima quimérica de la reivindicación 26.

29. Una célula huésped de hongo filamentoso unicelular o pluricelular que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 27.

30. Una célula huésped de la reivindicación 28 ó 29, en la que la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae,

Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

31. Una célula huésped de la reivindicación 30, en la que la célula huésped es Pichia pastoris.

Fase de lectura abierta de alfa-1, 2-manosidasa IA de M. musculus. Los dominios transmembrana y catalítico se destacan en negritasrespectivamente. La secuencia de los cebadores usados para generar los truncamientos N-terminal se destacan mediante subrayado y elinicio de cada fragmento de proteína respectivo se indica mediante una flecha.

219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237

Sistema Voyager Applied Biosystems 1246

Spec. N.º 1 de VoyagerNR (2, 00) (PB = 1664, 658)

Modo de Funcionamiento: Modo de Extracción Polaridad: Control de Adquisición:

Voltaje de Aceleración: Voltaje de rejilla: Cable guía 0: Texto ilegible:

Intervalo de masa de adquisición: N.º de disparos láser: Intensidad de láser: Índice de rep. de láser: Tipo de calibración: Matriz de calibración: Abertura de masa baja:

Texto ileg.: Tamaño de depósito: N.º de puntos de datos: Escala vertical: Compensación vertical: Ancho de banda de entrada:

Pocillo de muestra: ID de placa: N.º de serie: Nombre de instrumento: Nombre de archivo de tipo de placa: Nombre de laborotrio:

Posición X absoluta: Posición Y absoluta: Posición X relativa: Posición Y relativa: Disparos en espectro: Presión de fuente: Presión de espejo: Presión de TC2: Ancho de abertura de TiS: Texto ileg :

Lineal Retardado Positivo Manual

20000 V94%0, 005%100 ns

850 - 32000 Da 100/ espectro 271320, 0 Hz Por defecto Texto ileg 800 Da 18, 562Texto ileg 8676500 mV 0%150 Mhz

47100 WELL PLATE 1246Voyager-DE

C:\VOYAGER\100 well plate. PE Biosystems 31305, 628086, 1-761, 9131061, 831004.393, 00700, 00425330940

238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261