Expresión de N-acetilglucosaminiltransferasa III en eucariotas inferiores.

Un procedimiento para fabricar una glucoproteína recombinante en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso de eucariota inferior modificada para producir una glucoproteína que tiene una estructura central de Man3GlcNAc2 o de Man5GlcNAc2,

que comprende la etapa de introducir en la célula un ácido nucleico que codifica una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, en el que dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnTIII Δ32 de ratón o GnTIII Δ86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae.

Expresión de N-acetilglucosaminiltransferasa III en eucariotas inferiores Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones por los que se pueden modificar genéticamente células huésped de levadura o de hongo unicelular o multicelular filamentoso para producir proteínas glucosiladas (glucoproteínas) que tienen patrones de glucosilación similares a los de glucoproteínas producidas por células animales, especialmente células humanas, que son útiles como agentes terapéuticos, enseres humanos o animales.

Antecedentes de la invención Rutas de glucosilación en seres humanos y eucariotas inferiores Después de que el ADN se haya transcrito y traducido en una proteína, el procesamiento post-traduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un proceso conocido como glucosilación. Diferentes organismos producen diferentes enzimas de glucosilación (glucosiltransferasas y glucosidasas) y tienen diferentes sustratos disponibles (nucleótido azúcar) , de tal forma que los patrones de glucosilación así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que se está expresando la proteína particular. Las bacterias típicamente no glucosilan proteínas y si lo hacen, solamente de un modo muy inespecífico (Moens y Vanderley den (1997) Arch Microbiol. 168 (3) : 169-175) . Los eucariotas inferiores tales como hongos filamentosos y levaduras añaden principalmente azúcares manosa y manosilfosfato. El glucano resultante se conoce como un glucano de tipo quot;alto contenido de manosaquot; o un manano. Las células vegetales y las células de insecto (tales como células Sf9) glucosilan proteínas de otro modo. Por el contrario, en eucariotas superiores tales como seres humanos, la cadena lateral del oligosacárido naciente se puede cortar para eliminar varios restos de manosa y prolongar con restos de azúcar adicionales que típicamente no se encuentran en los Nglucanos de eucariotas inferiores. Véanse, por ejemplo, Bretthauer y col. (1999) Biotechnology and Applied Biochemistr y 30: 193-200; Martinet y col. (1998) Biotechnology Letters 20: 1171-1177; Weikert y col. (1999) Nature Biotechnology, 17: 1116-1121; M. Malissard y col. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications 267: 169-173; Jarvis y col., (1998) Current Opinion in Biotechnology 9: 528-533; y Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9: S29-S35.

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones secuenciales en el curso de las que se añaden y se eliminan restos de azúcar mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glucosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glucosilación resultantes de proteínas secretadas. Por tanto, el patrón de glucosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glucosilación de proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999) . La estructura de un N-glucano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las etapas tempranas de la glucosilación humana se pueden dividir en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 ligados a lípidos se ensamblan por un conjunto secuencial de reacciones en la membrana del retículo endoplásmico (RE) (Figura 13) y (ii) la transferencia de este oligosacárido de la estructura lipídica de sujección pirofosfato de dolicilo a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica se define por un resto de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr (SEC ID N.º: 1 y 2) donde Xaa puede ser cualquier aminoácido salvo prolina (Gavel y von Heijne (1990) Protein Eng. 3: 433-42) . Tiene lugar un procesamiento adicional por glucosidasas y manosidasas en el RE antes de que la glucoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, donde se eliminan restos de manosa adicionales por alfa (!) -1, 2-manosidasas específicas de Golgi. El procesamiento continúa cuando la proteína avanza a través del Golgi. En el Golgi medial, varias enzimas modificadoras, que incluyen N-acetilglucosaminil transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV) , manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y eliminan restos de azúcar específicos. Finalmente, en el Golgi trans, las galactosiltranferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) produce una estructura de glucoproteína que se libera del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri-y tetra-antenarias, que contienen galactosa, fucosa, Nacetilglucosamina y un alto grado de ácido siálico terminal, la que proporciona a las glucoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glucano humano típico se muestra en la Figura 1B. Véase también las Figuras 14 y 15 para etapas implicadas en el procesamiento de N-glucano de tipo mamífero.

En prácticamente todos los eucariotas, las glucoproteínas se obtienen de un precursor común de oligosacárido ligado a lípido Glc3Man9GlcNAc2-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplásmico, la síntesis y el procesamiento de oligosacáridos unidos a dolicol pirofosfato son idénticos en todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido central por células fúngicas, por ejemplo, levaduras, una vez que se ha transferido a un péptido que abandona el RE y que entra en el Golgi, difiere significativamente del de seres humanos cuando se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares de manosa.

En levaduras, estas etapas se catalizan por manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Ochlp, Mntlp y Mnnlp, que añaden secuencialmente azúcares de manosa al oligosacárido central. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas de tipo humano y por tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad de manosiltransferasa. Se ha demostrado que los mutantes de S. cerevisiae, deficientes en actividad de manosiltransferasa (por ejemplo, mutantes ochl1 o mnn9) son no mortales y presentan un contenido reducido de manosa en el oligosacárido de glucoproteínas de levadura. Puede que también se tengan que eliminar otras enzimas de procesamiento de oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasa, dependiendo del patrón de glucosilación endógeno particular del huésped.

Precursores de nucleótido azúcar

Los N-glucanos de glucoproteínas animales incluyen típicamente galactosa, fucosa y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentras en glucoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, toda la variedad de precursores de nucleótido azúcar (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-Nacetilgalactosamina, CMP-ácido-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen al oligosacárido central por glucosiltransferasas (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol. 91 (2) : A406-A406; Sommers y Hirschberg (1982) J. Biol. Chem. 257 (18) : 811-817; Perez y Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138: 709-715) .

Las reacciones de transferencia de glucosilo producen típicamente un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Mientras que los monofosfatos se pueden exportar directamente en intercambio por azúcares de nucleósido trifosfato por un mecanismo de cotransporte bidireccional, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir por fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir nucleósido monofosfato y fosfato inorgánico antes de ser exportados. Esta reacción es importante para la glucosilación eficaz; por ejemplo, se ha observado que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo, esa GDPasa tiene una actividad reducida el 90% con respecto a UDP (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269 (1) : 207-211) . Los eucariotas inferiores típicamente carecen de actividad de difosfatasa específica de UDP en el Golgi ya que no utilizan precursores de UDP-azúcar para síntesis de glucoproteína basada en Golgi. Se ha observado que Schizosaccharomyces pombe, una levadura de la que se ha observado que añade restos de galactosa a polisacáridos de pared celular (de UDP-galactosa) tiene actividad de UDPasa específica, indicando el requisito potencial de tal enzima (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. 269 (1) : 207-211) . Se sabe que el UDP es un inhibidor potente de glucosiltransferasas y la eliminación de este producto secundario de la glucosilación puede ser importante para evitar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para fabricar una glucoproteína recombinante en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso de eucariota inferior modificada para producir una glucoproteína que tiene una estructura central de Man3GlcNAc2 o de Man5GlcNAc2, que comprende la etapa de introducir en la célula un ácido nucleico que codifica una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, en el que dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnTIII #32 de ratón o GnTIII #86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las glucoproteínas recombinantes producidas por el procedimiento comprenden más del 10% en mol de estructuras de N-glucano bisecadas seleccionadas entre el grupo que consiste en GlcNAC3Man3GlcNAC2, GlcNAc2Man3GlcNAc2 y GlcNAc2Man5GlcNAc2.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III es sustancialmente intracelular.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de aislar la glucoproteína de la célula huésped.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae, Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica y Pichia sp.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la célula huésped es Pichia pastoris.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la glucoproteína es una proteína terapéutica.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo que consiste en eritropoyetina, citocinas, factores de coagulación, cadena ! de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de tripsina de urea, proteína de unión de IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de hormona de crecimiento, proteína de fusión de anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitor mieloide 1, osteoprotegerina, !-1-antitripsina, !-fetoproteína, ADNasa II, AAt, rhTBP-1, TACI-lg, FSH, GM-CSF, GLP-1 con y sin agonista de receptor FC de IL-1, sTNFr ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-lg.

10. Una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende una actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III, en la que dicha actividad es de una enzima que comprende el dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa III GnTIII #32 de ratón o GnTIII #86 de ratón fusionado con un péptido de dirección MNN2 de Saccharomyces cerevisiae.

11. La célula huésped de la reivindicación 10, que comprende además una actividad de Nacetilglucosaminiltransferasa I y/o de N-acetilglucosaminiltransferasa II.

12. La célula huésped de la reivindicación 10 u 11, en la que la célula es capaz de producir N-glucanos en glucoproteínas que comprenden estructuras de GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2 o GlcNAc2Man3GlcNAc2 que son capaces de reaccionar con una actividad de GnTIII.

13. La célula huésped de la reivindicación 10, en la que la célula huésped produce glucoproteínas que comprenden estructuras de N-glucano bisecados en una estructura central de Man5GlcNAc2 o Man3GlcNAc2.

14. La célula huésped de la reivindicación 10 u 11, en la que la célula huésped produce glucoproteínas que comprenden estructuras de N-glucano bisecado seleccionadas entre el grupo que consiste en GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2 y GlcNAc2Man5GlcNAc2.

15. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que comprende además una actividad de !-1, 2-manosidasa I y/o una actividad de manosidasa II.

16. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que es deficiente en una actividad de

OCH1 manosiltransferasa y/o actividad de Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-Dol manosiltransferasa.

17. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, que comprende además una actividad de transportador de UDP-GlcNAc.

18. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en la que las actividades son sustancialmente intracelulares.

19. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, en la que la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae, Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

20. La célula huésped de la reivindicación 19, en la que la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolic y Pichia sp.

21. La célula huésped de la reivindicación 20, en la que la célula huésped es Pichia pastoris.

22. Una composición de glucoproteína, en la que las glucoproteínas en dicha composición se preparan por el procedimiento de la reivindicación 8, carecen de fucosa y más del 10% en mol de los N-glucanos en las glucoproteínas en la composición comprenden una GlcNAc de bisección en una estructura central de Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2 o Man3GlcNAc2.

23. La composición de glucoproteína de la reivindicación 22, en la que más del 10% en mol de los N-glucanos en las glucoproteínas en la composición comprenden una GlcNAc de bisección unida a una estructura central seleccionada entre el grupo que consiste en: GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan4GlcNAc2 y GlcNAc2Man3GlcNAc2.

24. La composición de glucoproteína de la reivindicación 22, en la que más del 80% en mol de los N-glucanos en las glucoproteínas en la composición comprenden una GlcNAc de bisección unida a una estructura central seleccionada entre el grupo que consiste en: Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, Man3GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan4GlcNAc2 y GlcNAc2Man3GlcNAc2.

25. La composición de glucoproteína de la reivindicación 22, en la que más del 10% en mol de los N-glucanos en las glucoproteínas en la composición comprenden una estructura de bisección seleccionada entre el grupo que consiste en GlcNAc3Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc2Man4GlcNAc2 y GlcNAc2Man5GlcNAc2.

26. Una composición farmacéutica que comprende la glucoproteína de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25.

Matriz: BLOSUM62 Penalizaciones por Huecos: Existencia: 11, Extensión: 1 Número de Coincidencias con DB: 28883317 Número de Secuencias: 96469 Número de extensiones: 1107545 Número de extensiones exitosas: 2870 Número de secuencias mejores que 10, 0: 16 Número de HSP mejores que 10, 0 sin introducción de huecos: 5 Número de HSP con huecos introducidos de forma exitosa en ensayo prelim: 11 Número de HSP que han intentado la introducción de huecos en ensayos prelim: 2839 Número de HSP con huecos (no prelim) : 23

longitud de problema: 458 longitud de base de datos: 35.174.128 longitud de HSP eficaz: 45 longitud de problema eficaz: 413 longitud de base de datos eficaz: 30.833.023 espacio de búsqueda eficaz: 12734038499 espacio de búsqueda eficaz usado: 12734038499

T: 11

A: 40 X1: 15 (7, 1 bits) X2: 38 (14, 6 bits) X3: 64 (24, 7 bits) S1: 40 (21, 8 bits) S2: 67 (30, 4 bits)

FIG.16-4