Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped,

un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende

(a) un dominio catalítico de manosidasa seleccionado de la Tabla 11, fusionado a

(b) un péptido señal de dirección celular seleccionado de la Tabla 11,

en el que dicha enzima quimérica mostrada en la Tabla 11 es capaz de hidrolizar in vivo más del 40% de los enlaces Man a-1,3 y/o Man a-1,6 de un sustrato de GlcNAcMan5GlcNAc2

Expresión de manosidasa de clase II y manosidasa de clase III en células eucariotas inferiores.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de glicosilación de proteínas en levaduras u hongos filamentosos unicelulares o multicelulares, específicamente la introducción de una enzima manosidasa que tiene especificidad de sustrato para hidrólisis de enlaces glucosídicos Mana 1,3 y/o Mana 1,6. La presente invención se refiere además a células huésped novedosas que comprenden genes que codifican una enzima manosidasa y N-glicano o intermedios que contienen N-glicano producidos como resultado de la hidrólisis.

Antecedentes de la invención

Rutas de Glicosilación en Seres Humanos y Eucariotas Inferiores

Después de que el ADN se transcribe y se traduce en una proteína, el procesamiento post-traduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un procedimiento conocido como glicosilación. Organismos diferentes producen enzimas de glicosilación diferentes, (glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen sustratos diferentes (azúcares nucleótidicos) disponibles, de forma que los patrones de glicosilación, así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que la proteína particular se esté expresando. Las bacterias típicamente no glicosilan las proteínas y, si lo hacen, sólo de una manera muy inespecífica (Moens y Vanderleyden, 1997 Arch Microbiol. 168(3): 169-175). Los eucariotas inferiores, tales como hongos filamentosos y levaduras añaden principalmente los azúcares manosa y manosil fosfato. El glicano resultante se conoce como un glicano o un manano de tipo "de alto contenido en manosa". Las células vegetales y células de insecto (tales como las células Sf9) glicosilan las proteínas de otra manera. Por el contrario, en eucariotas superiores tales como seres humanos, la cadena lateral de oligosacáridos naciente se puede cortar para retirar varios restos de manosa y alargar con restos de azúcar adicionales que típicamente no se encuentran en N-glicanos de eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, R.K. Bretthauer, y col. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1999, 30, 193-200; W. Martinet, y col. Biotechnology Letters, 1998, 20, 1171-1177; Weikert S., y col. , Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; Malissard M., y col. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267,169-173; Jarvis, y col., Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9: 528-533; y M. Takeuchi, 1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9, S29-S35.

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones en secuencia durante el transcurso de las cuales se añaden y se retiran restos de azúcares mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glicosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glicosilación resultantes de proteínas secretadas. Por tanto, el patrón de glicosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glicosilación de proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999). La estructura de un N-glicano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las etapas tempranas de glicosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc₃Man₉GlcNAc₂ enlazados a lípidos se ensamblan mediante un conjunto de reacciones en secuencia en la membrana del retículo endoplasmático (RE) y (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el pirofosfato de dolichilo anclado a lípido a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica está definido por un resto de asparagina (ASN) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr donde Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne, 1990 Protein Eng. 3: 433-42). El procesamiento adicional mediante glicosidasas y manosidasas ocurre en el RE antes de que la glicoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, donde los restos de manosa adicionales se retiran mediante alfa manosidasas (a-1, 2-) específicas de Golgi. El procesamiento continúa a medida que la proteína avanza a través del Golgi. En el Golgi medio, varias enzimas modificadoras, incluyendo N-acetilglucosaminil Transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV), manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y retiran restos de azúcares específicos. Finalmente, en el Golgi trans, las galactosiltranferasas (GalT) y Sialiltransferasas (ST) producen una estructura de la glicoproteína que se libera a partir del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri- y tetra-antenarias, que contiene galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un ácido siálico terminal de grado elevado, que proporciona a las glicoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glicano humano típico se muestra en la Figura 1B.

En casi todos los eucariotas, las glicoproteínas se obtienen a partir de un precursor oligosacárido enlazado a lípido común Glc₃Man₉GlcNAc₂-dolichol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplasmático, la síntesis y procesamiento de oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolichol son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido de núcleo mediante células fúngicas, por ejemplo, levaduras, una vez que se ha transferido a un péptido que deja el RE y entra en el Golgi, difiere significativamente del de humanos ya que se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares manosa.

En levadura, estas etapas están catalizadas por las manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Och1p, Mntlp y Mnnlp, que añaden secuencialmente azúcares manosa al oligosacárido de núcleo. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas de tipo humano y, por tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Los mutantes de S. cerevisiae, que carecen de actividad manosil-transferasa (por ejemplo, mutantes de Och1 o mnn9) han demostrado ser no mortales y presentan contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura, pareciéndose más, por tanto, a oligosacáridos de eucariotas superiores.

Precursores de Nucleótidos de Azúcar

Los N-glicanos de glicoproteínas animales típicamente incluyen galactosa, fucosa, y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentran en glicoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, el intervalo completo de precursores de azúcares nucleotídicos (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, ácido CMP-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen al oligosacárido de núcleo mediante glicosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg, J. Cell Biol 1981. 91 (2): A406-A406; Sommers y Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257 (18): 811-817; Pérez y Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138:709-715).

Las reacciones de transferencia de glicosilo típicamente producen un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Mientras los monofosfatos se pueden exportar directamente como intercambio por azúcares trifosfato de nucleósido mediante un mecanismo de antiportador, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir monofosfatos de nucleósidos y fosfato inorgánico antes exportarse. Esta reacción es importante para la glicosilación eficaz; por ejemplo, se ha observado que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo, que GDPasa tiene una actividad reducida en el 90% hacia UDP (Berninsone y col., 1994 J. Biol. Chem. 269 (1): 207-211). Los eucariotas inferiores típicamente carecen de actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi, ya que los mismos no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteína basada en Golgi. Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha observado que añade restos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (a partir de UDP-galactosa) se ha observado que tiene actividad de UDPasa específica, indicando el requerimiento potencial de una enzima de este tipo (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem....

1. Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped, un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende

(a) un dominio catalítico de manosidasa seleccionado de la Tabla 11, fusionado a

(b) un péptido señal de dirección celular seleccionado de la Tabla 11,

en el que dicha enzima quimérica mostrada en la Tabla 11 es capaz de hidrolizar in vivo más del 40% de los enlaces Man a-1,3 y/o Man a-1,6 de un sustrato de GlcNAcMan₅GlcNAc₂.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la glicoproteína comprende N-glicanos seleccionados entre el grupo constituido por GlcNAcMan₃GlcNAc₂.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína comprende N-glicanos que comprenden la ramificación de oligosacárido Man a1,3 (Mana1,6) Manß1,4-GlcNAcß1,4-GlcNAc-Asn.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio catalítico de manosidasa es capaz de hidrolizar in vivo los enlaces tanto Mana1,3 y Mana1,6 de un sustrato de oligosacárido que comprende un enlace glicosídico Mana1,3 y uno Mana1,6.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4, en el que el sustrato de oligosacárido se caracteriza como GlcNAcß1,2 Mana1,3 (Mana1,6 Mana1,6) Manß1,4-GlcNAc ß1,4-GlcNAc-Asn; GlcNAcß1,2 Mana1,3 (Mana1,3 Mana1,6) Manß1,4-GlcNAcß1,4-GlcNAc-Asn; y GlcNAcß1,2 Mana1,3 (Mana1,3 Mana1,6 Mana1,6) Manß1,4-GlcNAcß1,4-GlcNAc-Asn.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa está sobreexpresada.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa además es capaz de hidrolizar un enlace Mana1,2.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el dominio catalítico de manosidasa está localizado dentro de al menos uno del RE, aparato de Golgi o la red de Golgi trans de la célula huésped.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo además la etapa de aislar la glicoproteína a partir de la célula huésped.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula huésped se selecciona entre el grupo constituido por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula huésped es Pichia pastoris.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína es una proteína terapéutica.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo constituido por eritropoyetina, citoquinas, factores de coagulación, cadena a de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa, inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de la hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitores mieloides 1, osteoprotegerina, a-1-antitripsina, a-feto proteína , AAT, rhTBP-1, es decir, onercept o proteína de unión a TNF1, TACI-Ig, es decir, activador transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina, FSH, es decir, hormona estimulante de folículos, GM-CSF, GLP-1, con y sin FC, es decir, proteína similar a glucagón 1, agonista del receptor de IL-1, sTNFr, es decir, enbrel o fusión Fc de receptor de TNF soluble, ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-lg, es decir, lg Antígeno 4 asociado con Linfocitos T Citotóxicos.

15. Una enzima quimérica como se muestra en la Tabla 11 que comprende un dominio catalítico de manosidasa fusionado en fase a un péptido señal de dirección celular, el cual tras la expresión en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso, es capaz de hidrolizar in vivo GlcNAcM₅GlcNAc₂ hasta el alcance que más del 40% de los enlaces Mana1,3 y/o Mana1,6 del sustrato se hidrolizan in vivo.

16. La enzima quimérica de la reivindicación 15, en la que, tras la expresión en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso, dicha enzima quimérica es capaz además de hidrolizar in vivo un sustrato de oligosacárido que comprende un enlace glicosídico Mana1,2 hasta el alcance que un resto detectable del enlace Mana1,2 del sustrato se hidroliza in vivo.

17. Un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica de la reivindicación 15 ó 16.

18. Una célula huésped que comprende una enzima quimérica de la reivindicación 15 ó 16.

19. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 17.

20. Una composición de glicoproteína en la que las glicoproteínas se producen en una célula huésped de la reivindicación 18 ó 19, no contienen fucosa y comprenden al menos el 40-50% en mol de GlcNAcMan₃GlcNAc₂.

21. Una composición de glicoproteína en la que las glicoproteínas se producen en una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, no contienen fucosa y comprenden al menos el 40-50% en mol de GlcNAcMan₃GlcNAc₂.

22. La composición de glicoproteína de la reivindicación 20 ó 21, en la que los N-glicanos de la glicoproteína son caracterizados como uniformes.