Biblioteca de ADN combinatoria para producir N-glucanos modificados en eucariotas inferiores.

Una célula huésped de un hongo unicelular o filamentoso que no presenta actividad α

1,6 manosiltransferasa conrespecto al N-glucano en una glucoproteína, comprendiendo dicha célula huésped un ácido nucleico que codificauna proteína de fusión que comprende el dominio catalítico de una α-1,2-manosidasa fusionada en el extremo N-terminal con un péptido señal de dirección celular SEC12, VAN1 o MNN10 para la producción de una estructura decarbohidrato de Man5GlcNAc2, en donde Man5GlcNAc2 se produce como un sustrato productivo para GnTI in vivodentro de la célula huésped a un rendimiento de al menos el 30 por ciento en moles.

Biblioteca de ADN combinatoria para producir N-glucanos modificados en eucariotas inferiores Declaración con respecto a la investigación patrocinada federalmente La presente invención se financió, al menos en parte, con una subvención estatal de los Institutitos Nacionales de la Salud (Subvención de NIH de Fase I n.º: 1R43GM66690-1) y una subvención del departamento de comercio, Número de Acuerdo de Cooperación de NIST-ATP 70NANB2H3046. Por lo tanto, el gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la presente invención.

Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones por los que pueden modificarse genéticamente células huésped eucariotas no humanas, tales como hongos u otras células eucariotas, para producir proteínas glucosiladas (glucoproteínas) que tienen patrones de glucosilación similares a los de glucoproteínas producidas por células animales, especialmente células humanas, que son útiles como agentes terapéuticos humanos o animales.

Antecedentes de la invención Rutas de glucosilación en humanos y eucariotas inferiores Después de que el ADN se transcriba y traduzca en una proteína, el procesamiento postraduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un proceso conocido como glucosilación. Diferentes organismos producen diferentes enzimas de glucosilación (glucosiltransferasas y glucosidasas) y tienen diferentes sustratos (azúcares de nucleótido) disponibles, de modo que los patrones de glucosilación así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que se exprese la proteína particular. Las bacterias normalmente no glucosilan proteínas y si lo hacen es solamente de una manera muy inespecífica (Moens y Vanderley den, 1997 Arch Microbiol. 168 (3) :169-175) . Los eucariotas inferiores tales como hongos filamentosos y levaduras añaden principalmente manosa y azúcares de manosilfosfato. El glucano resultante se conoce como un glucano del tipo de “alto contenido de manosa” o un manano. Las células vegetales y células de insecto (tales como células Sf9) glucosilan proteínas de otra manera más. Por el contrario, en eucariotas superiores tales como seres humanos, la cadena lateral de oligosacárido naciente puede reducirse para retirar varios restos de manosa y alargarse con restos de azúcar adicionales que normalmente no se encuentran en los Nglucanos de eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, R.K. Bretthauer y cols. Biotechnology and Applied Biochemistr y , 1999, 30, 193-200; W. Martinet y cols. Biotechnology Letters, 1998, 20, 1171-1177; S. Weikert y cols. Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; M. Malissard y cols. Biochemical and Biophysical Research

Communications, 2000, 267, 169-173; Jarvis y cols., Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9:528-533; y M. Takeuchi, 1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9, S29-S35.

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones secuenciales en el transcurso de las que se añaden y retiran restos de azúcar mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glucosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glucosilación resultantes de proteínas secretadas. Por lo tanto, el patrón de glucosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glucosilación de proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999) . La estructura de un N-glucano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las primeras etapas de la glucosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 unidos a lípidos se ensamblan por medio de un conjunto secuencial de reacciones en la membrana del retículo endoplásmico (RE) y (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el doliquil pirofosfato del anclaje lipídico a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica se define mediante un resto de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr en la que Xaa puede ser cualquier

aminoácido salvo prolina (Gavel, 1990) . Se produce un procesamiento adicional mediante glucosidasas y manosidasas en el RE antes de que la glucoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, en el que se retiran restos de manosa adicionales mediante alfa (!) -1, 2-manosidasas específicas de Golgi. El procesamiento continúa a medida que la proteína avanza a través del Golgi. En el Golgi medio, varias enzimas modificadoras, incluyendo N-acetilglucosaminil Transferasas (GnTI, GnTII, CmTIII, GnTIV y GnTV) , manosidasa II y

fucosiltransferasas, añaden y retiran restos de azúcar específicos. Finalmente, en el trans-Golgi, las galactosiltransferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) producen una estructura glucoproteica que se libera del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri-y tetra-antenarias, que contienen galactosa, fucosa, Nacetilglucosamina y un alto grado de ácido siálico terminal, la que proporciona a la glucoproteína sus características humanas. La estructura de un N-glucano humano típico se muestra en la Figura 1B.

En casi todos los eucariotas, las glucoproteínas derivan de un precursor oligosacárido unido a lípido común Glc3Man9GlcNAc2-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplásmico, la síntesis y el procesamiento de oligosacáridos unidos a dolicol pirofosfato son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido central por parte de células fúngicas, por ejemplo, levadura, una vez que se ha transferido a un péptido que deja el RE y entra en el Golgi, difiere significativamente de los seres humanos a medida que se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares de manosa.

En levaduras, estas etapas las catalizan manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Och1p, Mnt1p y Mnn1p,

que añaden secuencialmente azúcares de manosa al oligosacárido central. La estructura resultante no es deseable para la producción de proteínas de tipo humano y por lo tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Se ha mostrado que los mutantes de S. cerevisiae, deficientes en actividad manosiltransferasa (por ejemplo, mutantes och1 o mnn9) no son letales y presentan un contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glucoproteínas de levadura. Otras enzimas de procesamiento de oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasa, también pueden tener que eliminarse dependiendo del patrón de glucosilación endógeno particular del huésped.

Precursores de nucleótidos de azúcares Los N-glucanos de glucoproteínas animales normalmente incluyen galactosa, fucosa y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentran en glucoproteínas producidas en levadura y hongos filamentosos. En seres humanos, se sintetiza la serie completa de precursores de azúcares de nucleótido (por ejemplo UDP-N-acetilglucosamina; UDPN-acetilgalactosamina, CMP-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) en el citosol y se transportan al Golgi, en el que se unen al oligosacárido central mediante glucosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg, 1981 J. Cell Biol. 91 (2) : A406-A406; Sommers y Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257 (18) : 811-817; Perez y Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138: 709-715) .

Las reacciones de transferencia de glucosilo normalmente producen un producto secundario que es un nucleósido difosfato o un monofosfato. Aunque los monofosfatos pueden exportarse directamente en intercambio con azúcares de nucleósido trifosfatos por medio de un mecanismo antiportador, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) tienen que escindirlos las fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir nucleósido monofosfatos y fosfato inorgánico antes de exportarse. Esta reacción es importante para una glucosilación eficaz; por ejemplo, se ha descubierto que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para manosilación. Sin embargo, esa GDPasa tiene actividad reducida en un 90 % para UDP (Berninsone y cols., 1994 J. Biol. Chem. 269 (1) : 207-211) .

Los eucariotas inferiores normalmente carecen de actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi puesto que no usan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glucoproteínas basada en el Golgi. Se ha descubierto que Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha descubierto que añade restos de galactosa a polisacáridos 30 de la pared... [Seguir leyendo]

1. Una célula huésped de un hongo unicelular o filamentoso que no presenta actividad !1, 6 manosiltransferasa con respecto al N-glucano en una glucoproteína, comprendiendo dicha célula huésped un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende el dominio catalítico de una !-1, 2-manosidasa fusionada en el extremo Nterminal con un péptido señal de dirección celular SEC12, VAN1 o MNN10 para la producción de una estructura de carbohidrato de Man5GlcNAc2, en donde Man5GlcNAc2 se produce como un sustrato productivo para GnTI in vivo dentro de la célula huésped a un rendimiento de al menos el 30 por ciento en moles.

2. La célula huésped de la reivindicación 1, en donde la célula huésped es capaz de producir N-glucanos de los que más del 30 % en moles comprenden seis o menos residuos de manosa.

3. La célula huésped de la reivindicación 1 o 2, en donde la célula huésped es capaz de producir N-glucanos de los que más del 30 % en moles comprenden tres o menos residuos de manosa.

4. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula huésped es capaz de producir N-glucanos que comprenden uno o más azúcares seleccionados del grupo constituido por GlcNAc, galactosa, ácido siálico y fucosa.

5. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula huésped es capaz de producir N-glucanos con al menos una rama oligosacarídica que comprende la estructura NeuNAcGalGlcNAcMan.

6. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula huésped está seleccionada del grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae, Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

7. La célula huésped de la reivindicación 6, en donde el huésped es deficiente en la actividad de una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en manosiltransferasas y fosfomanosiltransferasas.

8. La célula huésped de la reivindicación 7, en donde el huésped no expresa una enzima seleccionada del grupo que consiste en 1, 6-manosiltransferasa, 1, 3-manosiltransferasa y 1, 2-manosiltransferasa.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en donde el huésped es un mutante och1 de P. pastoris.

10. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la célula huésped expresa adicionalmente actividades transportadoras de GnTI y UDP-GlcNAc.

11. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la !-1, 2-manosidasa se deriva de ratón, ser humano, Lepidoptera, Aspergillus nidulans o Bacillus sp., C. elegans, D. melanogaster, P. citrinum o X. laevis.

12. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la célula huésped incluye adicionalmente un ácido nucleico que codifica un dominio catalítico que codifica una actividad glucosidasa, manosidasa o glucosiltransferasa derivada de un miembro del grupo que consiste en GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnT V, GnT VI, GalT, Fucosiltransferasa y Sialiltransferasa y en donde el dominio catalítico tiene un pH óptimo dentro de 1, 4 unidades de pH del pH óptimo medio de otras enzimas representativas en el orgánulo en el que se localiza la enzima, o tiene actividad óptima a un pH entre 5, 1 y 8, 0.

13. La célula huésped de la reivindicación 12, en la que la manosidasa está seleccionada del grupo que consiste en manosidasa IA de C. elegans, manosidasa IB de C. elegans, manosidasa IA de D. melanogaster, manosidasa IB de

H. sapiens, manosidasa I de P. citrinum, manosidasa IA de ratón, manosidasa IB de ratón, manosidasa IA de A. nidulans, manosidasa IB de A. nidulans, manosidasa IC de A. nidulans, manosidasa II de ratón, manosidasa II de C. elegans, manosidasa II de H. sapiens y manosidasa III.

14. La célula huésped de la reivindicación 12 o 13, en la que la molécula de ácido nucleico codifica una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en UDP-GlcNAc transferasa, UDP-galactosiltransferasa, GDPfucosiltransferasa, CMP-sialiltransferasa, transportador de UP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa, transportador de CMP-ácido siálico y nucleótido difosfatasas.

15. La célula huésped de la reivindicación 12, en donde la célula huésped expresa además actividades del transportador de GnTI y de UDP-GlcNAc.

musculus. M.