Expresión de manosidasa de clase 2 y manosidasa de clase III en células eucariotas inferiores.

Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped,

un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende: (a) un dominio catalítico de manosidasa capaz de hidrolizar un sustrato oligosacáridos que comprende uno o los dos enlaces glicosídicos Manal 3 y/o Manal,6; condensado con

(b) un péptido señal de dirección celular que normalmente no está asociado con el dominio catalítico de (a), en el que dicho péptido señal de dirección celular está dirigido a dicho dominio catalítico de la manosidasa a la ruta secretora de la célula huésped en el que dicha enzima quimérica es capaz de hidrolizar in vivo al menos el 10% de los enlaces Manal,3 y/o Manal,6 de 10 un sustrato que comprende uno o los dos enlaces glicosídicos Manal,3 y Manal,6, de modo que convierte Man6GlacNAc2 en Man4GlacNAc2.

Expresión de manosidasa de clase 2 y manosidasa de clase III en células eucariotas inferiores Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la glicosilación de proteínas en levaduras u hongos filamentosos unicelulares o multicelulares, específicamente a la introducción de una enzima manosidasa que tiene especificidad de sustrato para hidrólisis de enlaces glucosídicos Mana 1, 3 y/o Mana 1, 6. La presente invención se refiere además a células huésped novedosas que comprenden genes que codifican una enzima manosidasa y N-glicano o intermedios que contienen N-glicano producidos como resultado de la hidrólisis.

Antecedentes de la invención

Rutas de glicosilación en seres humanos y eucariotas inferiores Después de que el ADN se transcribe y se traduce en una proteína, el procesamiento postraduccional adicional implica la unión de restos de azúcar, un proceso conocido como glicosilación. Organismos diferentes producen enzimas de glicosilación diferentes, (glicosiltransferasas y glicosidasas) , y tienen sustratos diferentes (azúcares nucleótidicos) disponibles, de forma que los patrones de glicosilación, así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso de la misma proteína, será diferente dependiendo del sistema huésped en el que la proteína particular se esté expresando. Las bacterias típicamente no glicosilan las proteínas y, si lo hacen, solo lo hacen de una manera muy inespecífica (Moens y Vanderley den, 1997 Arch Microbiol. 168 (3) : 169-175) . Los eucariotas inferiores, tales como los hongos filamentosos y las levaduras, añaden principalmente los azúcares manosa y manosil fosfato. El glicano resultante se conoce como un glicano o un manano de tipo "de alto contenido en manosa". Las células vegetales y las células de insecto (tales como las células Sf9) glicosilan las proteínas de otra manera. Por el contrario, en eucariotas superiores, tales como seres humanos, la cadena lateral de oligosacáridos naciente se puede cortar para eliminar varios restos de manosa y alargar con restos de azúcar adicionales que típicamente no se encuentran en los N-glicanos de eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, R.K. Bretthauer, y col. Biotechnology and Applied Biochemistr y , 1999, 30, 193-200; W. Martinet, y col. Biotechnology Letters, 1998, 20, 1171-1177; Weikert S., y col. , Nature Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; Malissard M., y col. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 267, 169-173; Jarvis, y col., Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9: 528-533; y M. Takeuchi, 1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, 9, S29-S35 .

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero comienza con un conjunto de reacciones en secuencia durante el transcurso de las cuales se añaden y se eliminan restos de azúcares mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glicosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glicosilación resultantes de proteínas secretadas. Por tanto, el patrón de glicosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente del patrón de glicosilación de proteínas expresadas en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999) . La estructura de un N-glicano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las etapas tempranas de glicosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 enlazados a lípidos se ensamblan mediante un conjunto de reacciones en secuencia en la membrana del retículo endoplasmático (RE) y (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el pirofosfato de dolichilo anclado a lípido a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica está definido por un resto de asparagina (ASN) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr donde Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne, 1990 Protein Eng. 3: 433-42) . El procesamiento adicional mediante glicosidasas y manosidasas ocurre en el RE antes de que la glicoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, donde los restos de manosa adicionales se retiran mediante alfa manosidasas (a-1, 2-) específicas de Golgi. El procesamiento continúa a medida que la proteína avanza a través del Golgi. En el Golgi medio, varias enzimas modificadoras, incluyendo N-acetilglucosaminil Transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV) , manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y retiran restos de azúcares específicos. Finalmente, en el Golgi trans, las galactosiltranferasas (GalT) y Sialiltransferasas (ST) producen una estructura de la glicoproteína que se libera a partir del Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri-y tetra-antenarias, que contiene galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un ácido siálico terminal de grado elevado, que proporciona a las glicoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glicano humano típico se muestra en la Figura 1B.

En casi todos los eucariotas, las glicoproteínas se obtienen a partir de un precursor oligosacárido enlazado a lípido común Glc3Man9GlcNAc2-dolichol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplasmático, la síntesis y procesamiento de oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolichol son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento adicional del oligosacárido de núcleo mediante células fúngicas, por ejemplo, levaduras, una vez que se ha transferido a un péptido que deja el RE y entra en el Golgi, difiere significativamente del de humanos ya que se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares manosa.

En levadura, estas etapas están catalizadas por las manosiltransferasas que residen en el Golgi, como Och1p, Mntlp y Mnnlp, que añaden secuencialmente azúcares manosa al oligosacárido de núcleo. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas de tipo humano y, por tanto, es deseable reducir o eliminar la actividad manosiltransferasa. Los mutantes de S. cerevisiae, que carecen de actividad manosil-transferasa (por ejemplo, mutantes de Och1 o mnn9) han demostrado ser no mortales y presentan contenido de manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura, pareciéndose más, por tanto, a oligosacáridos de eucariotas superiores.

Precursores de nucleótidos de azúcar

Los N-glicanos de glicoproteínas animales típicamente incluyen galactosa, fucosa, y ácido siálico terminal. Estos azúcares no se encuentran en glicoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En seres humanos, el intervalo completo de precursores de azúcares nucleotídicos (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-Nacetilgalactosamina, ácido CMP-N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) se sintetizan en el citosol y se transportan al Golgi, donde se unen al oligosacárido de núcleo mediante glicosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg, J. Cell Biol 1981. 91 (2) : A406-A406; Sommers y Hirschberg 1982 J. Biol. Chem. 257 (18) : 811-817; Pérez y Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138:709 --715) .

Las reacciones de transferencia de glicosilo típicamente producen un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Mientras los monofosfatos se pueden exportar directamente como intercambio por azúcares trifosfato de nucleósido mediante un mecanismo de antiportador, los difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) se tienen que escindir mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir monofosfatos de nucleósidos y fosfato inorgánico antes exportarse. Esta reacción es importante para la glicosilación eficaz; por ejemplo, se ha observado que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo, que GDPasa tiene una actividad reducida en el 90% hacia UDP (Berninsone y col., 1994 J. Biol. Chem. 269 (1) : 207-211) . Los eucariotas inferiores típicamente carecen de actividad difosfatasa específica de UDP en el Golgi, ya que los mismos no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteína basada en Golgi. Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha observado que añade restos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (a partir de UDP-galactosa) se ha observado que tiene actividad de UDPasa específica, indicando el requerimiento potencial de una enzima de este tipo (Berninsone y col. (1994) J. Biol. Chem. . 269 (1) : 207-211) . Se conoce que UDP es un inhibidor potente de glicosiltransferasas y la remoción de este producto secundario de la glicosilación puede ser importante para evitar la inhibición de glicosil-transferasa en el lumen... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir una glicoproteína en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso que comprende la etapa de expresar en la célula huésped, un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica que comprende:

(a) un dominio catalítico de manosidasa capaz de hidrolizar un sustrato oligosacáridos que comprende uno o los dos enlaces glicosídicos Manal 3 y/o Manal, 6; condensado con

(b) un péptido señal de dirección celular que normalmente no está asociado con el dominio catalítico de (a) , en el que dicho péptido señal de dirección celular está dirigido a dicho dominio catalítico de la manosidasa a la ruta secretora de la célula huésped

en el que dicha enzima quimérica es capaz de hidrolizar in vivo al menos el 10% de los enlaces Manal, 3 y/o Manal, 6 de un sustrato que comprende uno o los dos enlaces glicosídicos Manal, 3 y Manal, 6, de modo que convierte Man6GlacNAc2 en Man4GlacNAc2.

2.El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio catalítico IIx de manosidasa es el dominio catalítico de la alfa-manosidasa IIx humana (SEC ID Nº: 99) .

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho péptido señal de dirección celular se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces GLS1, Saccharomyces MNS1, Saccharomyces SEC12, Pichia SEC, Saccharomyces MNN9, Saccharomyces VAN1, Saccharomyces ANP1, Saccharomyces HOC1, Saccharomyces MNN10, Saccharomyces MNN11, Saccharomyces MNT1, Pichia D2, Pichia D9, Pichia J3, Saccharomyces KTR1, Saccharomyces KTR2, Kluyveromyces GnTI, Saccharomyces MNN2, Saccharomyces MNN5, Saccharomyces YUR1, Saccharomyces MNN1 y Saccharomyces MNN6.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la célula huésped expresa además al menos una actividad enzimática seleccionada del grupo que consiste en a-1, 2-manosidasa, el transportador UDP-GlcNAc, glicosiltransferasa (GnT) , galacosiltransferasa (GalT) y sialiltransferasa (ST) ) ,

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína comprende N-glicanos que comprenden Man3GlcNAc2, Man4GlcNAc2, GlcNAc2 Man3GlcNAc2 o GlcNAc2 Man3GlcNAc2

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína comprende N-glicanos que comprenden la rama de oligosacárido Mana1, 3 (Manal, 6) , Man11, 4-GlcNAc 11, 4-GlcNAc-Asn,

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa Ix tiene una especificidad de sustrato por Manα1, 2 Manal, 3 (Manal, 3 Manal, 6 Manal, 6) Manβ1, 4-GlcNAc β1, 4-GlcNAc-Asn; Manα1, 2 Manα1, 3 (Manα1, 6, Manα1, 6) Manβ1, 4-GlcNAc β1, 4-GlcNAc-Asn; Manα1, 2 Manal, 3 (Manal, 3 Manal, 6) Manβ1, 4-GlcNAc β1, 4-GlcNAc-Asn; o alto contenido en mananos.

8.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa IIx está sobreexpresada.

9.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la actividad manosidasa IIx tiene un pH óptimo de aproximadamente 5, 0 a aproximadamente 8, 0.

10.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx está localizado dentro de al menos uno del RE, aparato de Golgi o la red de Golgi trans de la célula huésped.

11.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx está codificado por un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio catalítico de manosidasa nativo de la la célula huésped.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx está codificado por un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un dominio catalítico de manosidasa heterólogo para la célula huésped.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx es una manosidasa IIx de células humanas.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el dominio catalítico de manosidasa IIx es el dominio catalítico de la alfa-manosidasa IIx humana (SEC ID Nº: 99) .

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima quimérica se expresa de

un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un péptido nativo de dirección celular nativo para la célula huésped.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enzima quimérica se expresa de un ácido nucleico que comprende secuencias que codifican un péptido nativo de dirección celular heterólogo para el dominio catalútico de la manosidasa.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de aislar la glicoproteína de la célula huésped.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae, Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

19.El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la célula huésped es Pichia pastoris.

20.El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glicoproteína es una proteína terapéutica.

21.El procedimiento de la reivindicación 20, en el que la proteína terapéutica se selecciona entre el grupo constituido por eritropoyetina, citoquinas, factores de coagulación, cadena a de receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleuquinas, uroquinasa, quimasa, inhibidor de tripsina urea, proteína de unión a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor de liberación de la hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, factor de crecimiento endotelial vascular 2, factor inhibidor de progenitores mieloides 1, osteoprotegerina, a-1-antitripsina, a-feto proteína , AAT, rhTBP-1 (onercept o proteína de unión a TNF1) , TACI-Ig (activador transmembrana y modulador de calcio e interactor de ligando de ciclofilina) , FSH (hormona estimulante de folículos) , GM-CSF, GLP-1, con y sin FC (proteína similar a glucagón 1) , agonista del receptor de IL-1, sTNFr (enbrel o fusión Fc de receptor de TNF soluble) , ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-lg (lg Antígeno 4 asociado con Linfocitos T Citotóxicos) .

22. Una biblioteca de ácido nucleico que comprende al menos dos constructos genéticos diferentes para expresión en una célula huésped hongo filamentoso unicelular o multicelular, que comprende fragmentos de ácido nucleico que codifican dominios catalíticos de la manosidasa IIx ligados en el mismo marco con fragmentos de ácido nucleico que codifican péptidos señal de dirección celular que normalmente no se asocian con el dominio catalítico.

23. La biblioteca de la reivindicación 22, en la que el dominio catalítico de la manosidasa IIx es una manosidasa IIx de célula humana.

24. La biblioteca de la reivindicación 23, en la que el dominio catalítico de la manosidasa IIx es el el dominio catalítico de la alfa-manosidasa IIx humana (SEC ID Nº: 99) .

25. La biblioteca de la reivindicación 22, e la que el fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido de dirección celular se selecciona del grupo que consiste en: Saccharomyces GLS 1, Saccharomyces MNS1, Saccharomyces SEC12, Pichia SEC, Pichia OCH1, Saccharomyces MNN9, Saccharomyces VAN1, Saccharomyces ANP1, Saccharomyces HOC1, Saccharomyces MNN10, Saccharomyces MNN11, Saccharomyces MNT1, Pichia D2, Pichia D9, Pichia J3, Saccharomyces KTR1, Saccharomyces KTR2, Kluyveromyces GnTI, Saccharomyces MNN2, Saccharomyces MNN5, Saccharomyces YLJR1, Saccharomyces MNN1, and Saccharomyces MNN6.

26.Una enzima quimérica que comprende un dominio catalítico de manosidasa IIx condensado en el mismo marco con un péptido señal de dirección celular que normalmente no se asocia con dicho dominio catalítico y dirige la enzima quimérica a la ruta secretora de la célula huésped, en la que tras la expresión en una célula huésped de levadura u hongo unicelular o multicelular filamentoso, es capaz de hidrolizar in vivo un sustrato oligosacáridos que comprende uno o los dos del enlace glicosífico Mana1, 3 y Manal, 6, hasta el alcance que al menos 10% de los enlaces Mana1, 3 y/o Manal, 6 del sustrato se hidrolizan in vivo.

27. La enzima quimérica de la reivindicación 26, en la que el dominio catalítico de la manosidasa IIx es el dominio catalítico de la alfa-manosidasa IIc humana (SEC ID Nº:99) .

28.Un ácido nucleico que codifica una enzima quimérica de la reivindicación 26.

29.Una célula huésped de hongo filamentoso unicelular o multicelular que comprende una enzima quimérica de la reivindicación 26.

30. Una célula huésped de hongo filamentoso unicelular o multicelular que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 28

31. Una célula huésped de la reivindicación 29 o 30, en el que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae,

Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus or y zae, Trichoderma reesei, Chr y sosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

32. Una célula huésped de la reivindicación 31, en la que la célula huésped es Pichia pastoris.

Fase de lectura abierta de alfa-1, 2-manosidasa IA de M. musculus. Los dominios transmembrana y catalítico se destacan en negritas respectivamente. La secuencia de los cebadores usados para generar los truncamientos N-terminal se destacan mediante subrayado y el inicio de cada fragmento de proteína respectivo se indica mediante una flecha.

FIG. 25 Manosidasa II de Arabidopsis thaliana (NM_121499)

FIG. 27 Manosidasa II de Ciona intestinalis (AK116648)

FIG. 29 Manosidasa II humana (U31520)

FIG. 31 Manosidasa II de rata (XM_218816)

FIG. 33 Manosidasa II de células de insecto (AF005034)

FIG. 35 Manosidasa II citoplasmática humana (NM_006715)