Métodos para eliminar la manosilfosforilación de glucanos en la producción de glucoproteínas.

Un hospedador fúngico que comprende una disrupción, una deleción o una mutación combinadas de los genes MNN4B y PNO1 en donde el hospedador fúngico es Pichia pastoris y es capaz de producir menos del 1 % de glucoproteínas manosilfosforiladas de los N-glucanos totales en donde el gen de MNN4B en el que hay que provocar una disrupción,

suprimir o mutar codifica un ARN mensajero que se corresponde con un ADNc que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en

(a) SEC ID Nº: 3;

(b) una secuencia de ácido nucleico que es una variante degradada de SEC ID Nº: 3;

(c) una secuencia de ácido nucleico al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,9 % idéntica a SEC ID Nº: 3;

(d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 4; y

(e) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99,9 % idéntico a SEC ID Nº: 4.

Métodos para eliminar la manosilfosforilación de glucanos en la producción de glucoproteínas Campo de la invención La presente invención se refiere a la eliminación de la transferencia de manosilfosfato en glucanos de glucoproteínas, y se refiere además a eliminar genes responsables de la adición de restos de manosilfosfato en glucanos en Pichia pastoris.

En particular, la invención se refiere a modificar por ingeniería genética células hospedadoras de P. pastoris para producir glucanos sin restos de manosilfosfato.

Antecedentes de la invención La capacidad para producir proteínas humanas recombinantes ha conducido a avances importantes en el cuidado de la salud humana y sigue siendo un área activa de descubrimiento de fármacos. Muchas proteínas terapéuticas requieren la adición cotraduccional de glucanos a restos de asparagina específicos (N-glucosilación) de la proteína para asegurar la actividad de función estructural apropiada y posterior estabilidad en suero humano. Para el uso terapéutico en seres humanos, las glucoproteínas requieren N-glucosilación de tipo humano. Las líneas celulares de mamífero (células de ovario de hámster Chino (CHO) así como células retinianas humanas) que pueden imitar el procesamiento de glucoproteína de tipo humano tiene varios inconvenientes incluyendo bajos títulos de proteínas, largos tiempo de fermentación, productos heterogéneos y problemas de contenimiento viral continuados. Por lo tanto, el uso de sistemas de expresión de levadura y hongos filamentosos que tienen procesamiento más económico, menos obstáculos de seguridad y que producen rendimientos de proteína heteróloga más robustos se han investigado exhaustivamente como células hospedadoras para productos terapéuticos humanos.

En levadura y hongos filamentosos, se producen glucoproteínas que tienen oligosacáridos que son diferentes de los de glucoproteínas derivadas de mamífero. Específicamente en levadura, los oligosacáridos de cadena externa son hipermanosilados que consisten en 30-150 restos de manosa (Kukuruzinska et al., 1987, Annu. Rev. Biochem. 56: 915-944) . Además, el manosilfosfato se transfiere con frecuencia tanto al núcleo como a las cadenas de azúcares externas de glucoproteínas producidas en levadura (Ballou, 1990, Method Enzymol. 185: 440-470) . Es más importante que se ha mostrado que estos glucanos manosilfosforilados de glucoproteínas producidas en la levadura, Saccharomyces cerevisiae, inducen una respuesta inmunitaria en conejos (Rosenfeld y Ballou, 1974, JBC, 249: 2319-2321) . Por lo tanto, la eliminación de la manosilfosforilación en levadura y hongos filamentosos es esencial para la producción de glucoproteínas terapéuticas no inmunogénicas.

En S. cerevisiae hay al menos dos genes que participan en la transferencia de manosilfosfato. Los dos genes, MNN4 y MNN6 se han clonado, y los análisis de los productos génicos sugieren que actúan en la transferencia del manosilfosfato (para una revisión véase Jigami y Odani, 1999, Biochim. Biophys. Acta, 1426: 333-345) . MNN6 codifica una proteína de membrana de tipo II homóloga de la familia Kre2p/Mnt1p de proteínas que se ha caracterizado como α-1, 2 manosiltransferasas del Golgi implicadas en la O-manosilación y N-glucosilación (Lussier et al., 1997, JBC, 272: 15527-15531) . El mutante Δmnn6 no muestra un defecto en la manosilfosforilación de los glucanos principales in vivo, pero muestra una reducción de la actividad manosilfosfato transferasa in vitro (Wang et al., 1997, JBC, 272: 18117-18124) . Mnn4p también es una proteína de membrana de tipo n potencial que es 33 % idéntica a la Yjr061p de S. cerevisiae (Odani et al., 1996, Glycobiology, 6: 805-810; Hunter y Plowman, 1997, Trends in Biochem. Sci., 22: 18-22) . Los mutantes tanto de Δmnn6 como de Δmnn4 reducen la transferencia de manosilfosfato. Sin embargo, el mutante doble Δmnn6 Δmnn4 no reduce adicionalmente esta actividad. Estas observaciones sugieren la presencia de manosiltransferasas adicionales que añaden manosilfosfato a los glucanos principales.

Por lo tanto, a pesar de la reducción de la manosilfosforilación en S. cerevisiae con la disrupción de MNN4, MNN6 o ambos en combinación, no hay pruebas de que la eliminación completa de la actividad manosilfosfato transferasa sea posible. Otros genes que afectan a los niveles de manosilfosfato se han identificado en S. cerevisiae. Estos genes incluyen PMR1, VRG4, MNN2 y MNN5. PMR1 codifica una Ca2+/Mn2+-ATPasa localizada en el Golgi requerida para la función normal del aparato de Golgi (Antebi y Fink, 1992, Mol. Biol. Cell, 3: 633-654) ; Vrg4p está implicado en el transporte del azúcar nucleotídico en el Golgi (Dean et al., 1997, JBC, 272: 31908-31914) , y Mnn2p y Mnn5p son α1, 2-manosiltransferasas responsables del inicio de la ramificación en la cadena externa de glucanos ligados a N (Rayner y Munro, 1998, JBC, 273: 23836-23843) . Para las cuatro proteínas, la reducción en los grupos de manosilfosfato unidos a los glucanos ligados a N parece ser una consecuencia de la disfunción del Golgi o una reducción en el tamaño de los glucanos ligados a N en lugar de un defecto específico en la actividad de transferencia de los grupos de manosilfosfato. El documento US-A 2002/0137134 describe la provisión de células eucariotas inferiores, en particular Pichia pastoris, que tienen una ruta de glucosilación modificada genéticamente que imita el procesamiento de las glucoproteínas en seres humanos. Las modificaciones pueden implicar la eliminación de manosilfosfato transferasas (MNN4, MNN6, o genes que complementan a los mutantes lbd) .

Las proteínas expresadas en la levadura metilotrópica, Pichia pastoris, contienen glucanos manosilfosforilados (Miele, et al., 1997, Biotech. Appl Biochem., 2: 79-83) . Miura et al., presentaron la identificación del gen PNO1 (Fosforil manosilación de Oligosacáridos ligados a N) que tras su disrupción confiere una atenuación de la manosilfosforilación en glucoproteínas (documento WO 01/88143; Miura et al., 2004, Gene, 324: 129-137) . El gen PNO1 codifica una proteína implicada en la transferencia de manosilfosfato a glucanos en P. pastoris. Su función específica, sin embargo, se desconoce. Como se ha mencionado, el mutante Δpnol reduce pero no anula la manosilfosforilación en N-glucanos en relación con un cepa de P. pastoris que tiene Pnolp de tipo silvestre.

En la actualidad, no existen métodos para eliminar la manosilfosforilación en glucoproteínas producidas en hospedadores fúngicos. Una cantidad residual de manosilfosforilación en glucoproteínas aún puede ser inmunogénica y, por lo tanto, es indeseable como productos terapéuticos humanos.

Lo que se necesita, por lo tanto, es un sistema de expresión basado en levadura u hongos filamentosos que produzca glucoproteínas que estén esencialmente sin glucanos manosilfosforilados.

Sumario de la invención La presente divulgación proporciona un método para eliminar restos de manosilfosfato en glucanos de glucoproteínas en un hospedador fúngico de P. pastoris.

La presente invención proporciona un hospedador fúngico que produce de forma normal glucoproteínas manosilfosforiladas o una fracción de las mismas, modificándose dicho hospedador fúngico para producir glucoproteínas esencialmente sin restos de manosilfosfato. En particular, la presente invención proporciona un hospedador fúngico que comprende una disrupción, una deleción o una mutación combinadas de los genes MNN4B y PNO1 en el que el hospedador fúngico es Pichia pastoris y es capaz de producir menos del 1 % de glucoproteínas manosilfosforiladas de N-glucanos totales en el que el gen MNN4B en el que hay que provocar una disrupción, suprimir o mutar codifica un ARN mensajero que se corresponde con un ADNc que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en

(a) SEC ID Nº : 3;

(b) una secuencia de ácido nucleico que es una variante degradada de SEC ID Nº : 3;

(c) una secuencia de ácido nucleico al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99, 9 % idéntica a SEC ID Nº : 3;

(d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99, 9 % idéntica a SEC ID Nº : 4.

Además, la presente invención proporciona un método para producir composiciones de glucoproteínas en el hospedador fúngico de la invención que comprende propagar dicho hospedador fúngico... [Seguir leyendo]

1. Un hospedador fúngico que comprende una disrupción, una deleción o una mutación combinadas de los genes MNN4B y PNO1 en donde el hospedador fúngico es Pichia pastoris y es capaz de producir menos del 1 % de glucoproteínas manosilfosforiladas de los N-glucanos totales en donde el gen de MNN4B en el que hay que provocar una disrupción, suprimir o mutar codifica un ARN mensajero que se corresponde con un ADNc que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en

(a) SEC ID Nº : 3; 10 (b) una secuencia de ácido nucleico que es una variante degradada de SEC ID Nº : 3;

(c) una secuencia de ácido nucleico al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99, 9 % idéntica a SEC ID Nº : 3;

(d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC 15 IDNº :4;y

(e) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, al menos 99 % o al menos 99, 9 % idéntico a SEC ID Nº : 4.

2. Un método para producir composiciones de glucoproteínas en un hospedador fúngico de la reivindicación 1 que comprende propagar dicho hospedador fúngico y aislar los productos de glucoproteínas.