Procedimiento para preparar un producto inmunógeno anti-FNTα

, que comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar una solución líquida que contiene FNTα;

b) añadir EDTA a dicha solución líquida que contiene FNTα de la etapa a);

c) añadir una proteína transportadora a la solución líquida obtenida al final de la etapa b);

d) añadir glutaraldehído a una mezcla líquida obtenida al final de la etapa c);

e) eliminar el glutaraldehído y las moléculas libres tanto de FNTα como de dicha proteína transportadora de la solución obtenida al final de la etapa d);

f) añadir formaldehído a la solución líquida obtenida al final de la etapa e), y mantener la presencia de formaldehído durante un periodo comprendido entre 96 horas y 192 horas;

g) añadir un reactivo que bloquea la reacción con formaldehído a la solución líquida obtenida al final de la etapa f); y

h) eliminar el formaldehído y el reactivo de bloqueo de la solución líquida obtenida al final de la etapa h), con el fin de obtener una solución líquida que contiene dicho producto inmunógeno anti-FNTα

Procedimiento para la preparación de un producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos antigénicos de FNT alfa y una proteína transportadora.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos antigénicos de FNTa y una proteína transportadora para obtener una respuesta inmunitaria humoral en un mamífero con producción de anticuerpos que neutralizan la actividad biológica del FNTa, así como a un procedimiento para preparar su preparación.

Dicho producto inmunógeno estable puede denominarse también producto inmunógeno anti-FNTa o también un producto inmunógeno para producir anticuerpos anti-FNTa.

La presente invención se refiere además a varias composiciones que comprenden dicho producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos antigénicos de FNTa y una proteína transportadora así como a los procedimientos de preparación de las mismas.

Antecedentes de la invención

Un procedimiento general para preparar un producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos antigénicos que comprenden una o más proteínas antigénicas de interés y por lo menos una proteína transportadora se ha descrito en la solicitud PCT publicada con el nº WO 2004/024189 en la denominación de NEOVACS. Particularmente, dicha solicitud PCT dio a conocer un procedimiento para preparar dichos heterocomplejos utilizando FNTa como antígeno de interés y KLH como proteína transportadora. Dicho procedimiento general de la técnica anterior, cuando se realizó para preparar heterocomplejos que comprenden FNTa y KLH, comprendía las etapas siguientes:

a) obtener una mezcla de KLH con FNTa; b) añadir a dicha mezcla glutaraldehído a una concentración final de 0, 026 M; c) eliminar el exceso de glutaraldehído realizando una diálisis; d) añadir formaldehído a la solución dializada y mantener la presencia de formaldehído durante un periodo de 48

horas; e) añadir glicina a la solución obtenida al final de la etapa d) ; y f) realizar una diálisis con la solución obtenida al final de la etapa e) .

Los ejemplos de la solicitud PCT nº WO 2004/024189 demostraron que el producto inmunógeno FNTa/KLH resultante era estable y podía aumentar la producción de anticuerpos que poseen una buena actividad neutralizante contra el FNTa natural.

Sin embargo, posteriormente, parecía que resultaban necesarios heterocomplejos más eficaces para satisfacer el nivel de requisitos elevados de varias autoridades sanitarias, incluyendo los Estados Unidos y Europa, para preparar composiciones de vacunas adecuadas que contienen dichos heterocomplejos como principal principio activo.

Descripción detallada de la invención

Se ha descubierto que cuando el procedimiento general dado a conocer en la solicitud PCT nº WO 2004/024189, se aplica a heterocomplejos que comprenden FNTa y una proteína transportadora, conducen a productos inmunógenos finales en los que tanto la inactivación como la inmunogenicidad del FNTa tendrían que mejorarse, habida cuenta la preparación de las composiciones de la vacuna anti-FNTa que deben ser aprobadas por varias autoridades sanitarias en todo el mundo. El solicitante ha descubierto también que la estabilidad del producto inmunógeno completo debería mejorarse, fundamentalmente para aumentar su estabilidad en el tiempo de almacenamiento.

Se ha descubierto recientemente un nuevo procedimiento para preparar un producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos antigénicos de FNTa y una proteína transportadora que permite alcanzar varios objetivos descritos anteriormente.

Un objeto de la presente invención consiste en un procedimiento para preparar un producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos antigénicos de FNTa y una proteína transportadora, que comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar una solución líquida que contiene FNTa;

b) añadir EDTA a dicha solución líquida que contiene FNTa de la etapa a) ;

c) añadir una proteína transportadora a la solución líquida obtenida al final de la etapa b) , para obtener una mezcla líquida de FNTa y dicha proteína transportadora;

d) añadir glutaraldehído a una mezcla líquida obtenida al final de la etapa c) , con el fin de conjugar en parte por enlace covalente las moléculas del FNTa con dicha proteína transportadora y obtener heterocomplejos entre FNTa y dicha proteína transportadora;

e) eliminar el glutaraldehído y las moléculas libres tanto de FNTa como de dicha proteína transportadora de la solución obtenida al final de la etapa d) , con el fin de obtener una solución líquida que contiene heterocomplejos purificados entre el FNTa y dicha proteína transportadora;

f) añadir formaldehído a la solución líquida obtenida al final de la etapa e) , y mantener la presencia de formaldehído durante un periodo que oscila entre 96 horas y 192 horas;

g) añadir un reactivo que bloquea la reacción con formaldehído a la solución líquida que contiene heterocomplejos entre FNTa y dicha proteína transportadora, obtenida al final de la etapa f) ; y h) eliminar el formaldehído y el agente de bloqueo procedente de la solución líquida obtenida al final de la etapa g) , con el fin de obtener una solución líquida que contiene dicho producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos entre FNTa y dicha proteína transportadora.

Al realizar el procedimiento descrito anteriormente, los productos inmunógenos estables resultantes están provistos de una capacidad aumentada para inducir la producción de anticuerpos que neutralizan el FNTa natural, cuando se administran a un mamífero junto con uno o más complejos inmunoadyuvantes.

Un "producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos antigénicos de FNTa y una proteína transportadora", tal como se utiliza en la presente memoria, consiste en un producto inmunógeno que produce anticuerpos que neutralizan la actividad biológica de FNTa, cuyo producto inmunógeno comprende asociaciones de proteínas entre (i) moléculas de FNTa y (ii) moléculas transportadoras, en las que menos del 40% de las moléculas FNTa están unidas a las moléculas transportadoras por enlaces químicos covalentes.

El producto inmunógeno estable preparado por el procedimiento anterior es "inmunógeno" porque produce anticuerpos contra FNTa natural en un paciente, después de su administración a dicho paciente, y más específicamente anticuerpos que neutralizan la actividad biológica del FNTa natural.

El producto inmunógeno preparado por el procedimiento anterior es "estable" ya que dicho producto inmunógeno posee su propio punto isoeléctrico que puede distinguirse del punto isoeléctrico de por lo menos (i) FNTa (ii) la molécula transportadora, y ya que dicho producto inmunógeno migra, en un ensayo de isoelectroenfoque, como una banda de proteína que se distingue de por lo menos una de las dos bandas de proteínas correspondientes a (i) FNTa y (ii) la molécula transportadora, respectivamente. Esto significa que un producto inmunógeno según la invención no comprende moléculas de FNTa libres no unidas ni moléculas de proteína transportadora libres no unidas.

El producto inmunógeno preparado por el procedimiento anterior comprende "heterocomplejos antigénicos" o "heterocomplejos" de FNTa y una proteína transportadora porque dicho producto inmunógeno comprende (i) el FNTa antigénico y (ii) las moléculas de proteína transportadora antigénica que están unidas (a) parcialmente por enlaces covalentes (menos de 40% de enlaces covalentes) y (b) parcialmente por enlaces no covalentes débiles (más del 60% de enlaces no covalentes) que contienen interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, interacciones de Van del Waals, etc.

El producto inmunógeno estable que comprende heterocomplejos antigénicos de FNTa y una proteína transportadora que se definió anteriormente, que puede prepararse según el procedimiento de la invención, puede también calificarse de forma más sencilla en la presente memoria como un producto inmunógeno para producir, o que produce, anticuerpos anti-FNTa en un ser humano o en un animal, o también como un producto inmunógeno anti-FNTa.

Gracias a las etapas combinadas del procedimiento según la invención, el producto inmunógeno estable final se obtiene con una reproduccibilidad mayor que los heterocomplejos que comprenden FNTa y... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para preparar un producto inmunógeno anti-FNTa, que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una solución líquida que contiene FNTa; b) añadir EDTA a dicha solución líquida que contiene FNTa de la etapa a) ; c) añadir una proteína transportadora a la solución líquida obtenida al final de la etapa b) ; d) añadir glutaraldehído a una mezcla líquida obtenida al final de la etapa c) ; e) eliminar el glutaraldehído y las moléculas libres tanto de FNTa como de dicha proteína transportadora de la

solución obtenida al final de la etapa d) ; f) añadir formaldehído a la solución líquida obtenida al final de la etapa e) , y mantener la presencia de formaldehído durante un periodo comprendido entre 96 horas y 192 horas; g) añadir un reactivo que bloquea la reacción con formaldehído a la solución líquida obtenida al final de la etapa f) ; y h) eliminar el formaldehído y el reactivo de bloqueo de la solución líquida obtenida al final de la etapa h) , con el fin de obtener una solución líquida que contiene dicho producto inmunógeno anti-FNTa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende las etapas siguientes: b1) añadir EDTA a dicha solución líquida que contiene FNTa de la etapa a) ; y b2) añadir DMSO a la solución líquida obtenida al final de la etapa b1) .

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la etapa d) comprende las etapas siguientes:

d1) añadir glutaraldehído a la mezcla líquida obtenida al final de la etapa c) ; y d2) añadir EDTA a los heterocomplejos entre FNTa y dicha proteína transportadora obtenida al final de la etapa d1) .

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa a) la concentración de FNTa está comprendida entre 0, 1 mg/ml y 50 mg/ml.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa a) la concentración de FNTa está comprendida entre 0, 5 mg/ml y 10 mg/ml.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la etapa b) la concentración de EDTA está comprendida entre 1 mM y 500 mM.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que en la etapa b2) la concentración de DMSO está comprendida entre 0, 5% v/v y 20% v/v.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que en la etapa c) la relación molar de FNTa a dicha proteína transportadora está comprendida entre 5:1 y 100:1.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que en la etapa d) la concentración final de glutaraldehído está comprendida entre 0, 05% p/p y 0, 5% p/p.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que en la etapa d2) la concentración final de EDTA está comprendida entre 1 mM y 10 mM.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en la etapa e) el glutaraldehído se elimina realizando una diálisis, realizando una ultrafiltración con filtración por diálisis o realizando una filtración en flujo tangencial (FFT) .

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que en la etapa f) , la concentración lineal

de formaldehído está comprendida entre 1% p/p y 10% p/p.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que en la etapa f) , la concentración lineal de formaldehído está comprendida entre 2% p/p y 5% p/p.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que en la etapa f) la presencia de formaldehído se mantiene durante un periodo de tiempo comprendido entre 120 horas y 168 horas.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que en la etapa g) , el reactivo de bloqueo consiste en glicina.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que en la etapa g) la concentración final de glicina está comprendida entre 0, 01 M y 10 M.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que en la etapa g) la concentración final de glicina está comprendida entre 0, 05 M y 2 M.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que en la etapa g) , el reactivo de bloqueo consiste en lisina.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que en la etapa g) la concentración de lisina final está comprendida entre 0, 01 M y 10 M.

20. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que en la etapa g) la concentración de lisina final está comprendida entre 0, 05 M y 0, 5 M.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que en la etapa h) , el formaldehído y el agente de bloqueo se eliminan realizando una diálisis, realizando una ultrafiltración con filtración por diálisis, o realizando filtración en flujo tangencial (FFT) .

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que dicha proteína transportadora se selecciona de entre el grupo constituido por la vacuna antidiftérica (DT) y sus mutantes, la vacuna antitetánica (TT) , hemocianina de la lapa californiana (KLH) , y la proteína purificada derivada de la tuberculina (PPD) , OMPC de N. meningitidis, la proteína purificada derivada de la tuberculina (PPD) , la albúmina del suero bovino (ASB) y la proteína D de Haemophilus influenzae.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicha proteína transportadora consiste en la hemocianina de la lapa californiana (KLH) .

24. Procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende las etapas siguientes:

a) preparar un producto inmunógeno anti-FNTa realizando el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23; y b) combinar dicho producto inmunógeno anti-FNTa preparado en la etapa a) con uno o más inmunoadyuvantes.

25. Producto inmunógeno anti-FNTa preparado por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.

26. Composición inmunógena que comprende un producto inmunógeno anti-FNTa preparado por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

27. Composición de vacuna que comprende un producto inmunógeno anti-TNFa preparado por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en combinación con uno o más inmunoadyuvantes.