Procedimiento de preparación y aislamiento de fosfátidos.

Procedimiento de preparación de fosfatidilserina de fórmula en la que R1 y R2 representan,

independientemente, un acilo C10-C30, saturado, mono-insaturado o poliinsaturado, X=OH o OM, en la que M = metal alcalino o alcalinotérreo, amonio, alquilamonio (incluyendo la sal interna), incluyendo la reacción de transfosfatidilación entre un compuesto de la fórmula general en la que R1 y R2 y X tienen los significados especificados anteriormente, R3 = CH2-CH2-NH2 o CH2-CH2-N+ (CH3) 3 y serina en forma D, L o racémica catalizada por la enzima fosfolipasa D (PLD), caracterizado porque dicha reacción es llevada a cabo en un medio hidroalcohólico que contiene un alcohol alifático y en presencia de óxido de metal bivalente.

Procedimiento de preparación y aislamiento de fosfátidos Objeto de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para la producción y la purificación de fosfatidilserina (PS) , para obtener el producto final con un alto rendimiento, por medio de óxidos de metales bivalentes (BMO) .

Campo de la invención El declive funcional del Sistema Nervioso Central (SNC) , que ocurre durante el proceso fisiológico del envejecimiento cerebral, causa, frecuentemente, el deterioro de las funciones cognitivas en las personas mayores, lo que, a su vez, puede provocar trastornos de conducta y alteraciones de la memoria temporal y espacial.

Este declive funcional en la actividad del SNC está vinculado tanto con la aparición de alteraciones bioquímicas y estructurales en la composición lipídica de las membranas neuronales como en la disminución de la actividad de las enzimas cerebrales, que puede reducir las sinapsis neuronales.

La fosfatidilserina (PS) es el principal fosfolípido ácido en el cerebro. Por lo tanto, la investigación científica se ha centrado durante algún tiempo en la búsqueda de un tratamiento farmacológico para los trastornos cognitivos relacionados con la edad, basado en fosfolípidos, que puede prevenir (y/o reconstruir parcialmente) el déficit estructural y funcional de las membranas neuronales envejecidas.

Estudios preclínicos y clínicos en seres humanos han demostrado que la administración de PS por vía oral, especialmente en los ancianos, puede determinar un incremento significativo en la capacidad de aprendizaje y la memoria temporal y espacial, incluso en el caso de patologías particularmente discapacitantes, tales como la enfermedad de Alzheimer (Cenacchi T. et al.; Aging Clin Exp Res, 1993, 5:123-133; Nunzi MG et al.; Adv Exp Med Biol, 1992; 318:393-8) .

Además, se ha demostrado que la fosfatidilserina es capaz de combatir el incremento en la hormona cortisol en sujetos sometidos a estrés físico (Monteleone P. et al.; Neuroendocrinology, 1990, 52 (3) :243-8) , reduciendo, de esta manera, el catabolismo de la glucosa, con una mayor recuperación funcional después de un esfuerzo físico intenso.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis y la purificación de PS y al uso de PS como el principio activo en fármacos (y/o complementos alimenticios) para la prevención de las patologías relacionadas con la edad, indicadas anteriormente, y en la preparación de suplementos alimenticios indicados para todos los casos de estrés físico intenso y, además, en la producción de liposomas para su uso en el campo de la cosmética y/o como un sistema de liberación controlada para los fármacos que contienen.

Los procedimientos de producción y purificación de PS, ya conocidos en la literatura científica y en patentes, describen la conversión enzimática de fosfatidilcolina (PC) en PS mediante una reacción de transfosfatidilación catalizada por la enzima fosfolipasa D (PLD) , con la subsiguiente purificación realizada principalmente mediante la extracción de la PS con solventes orgánicos.

En los últimos años, se han perfeccionado diversos procedimientos para la síntesis de PS mediante conversión enzimática en sistemas de dos fases de agua/solvente orgánico o en un medio acuoso.

El documento EP 0776976 describe un procedimiento de preparación enzimática de PS en un sistema que consiste en agua/tolueno, en el que la fase orgánica contiene el fosfolípido de partida a partir del cual se forma la PS, la fase acuosa contiene el aceptor hidroxi y la reacción de síntesis ocurre en la interfaz agua/solvente, en presencia de fosfolipasa D cruda, a partir de caldos de fermentación de cepas de microorganismos que producen PLD.

Por primera vez, en 1990, los investigadores trataron de eludir el sistema de dos fases, ya que requería grandes cantidades de solvente, que luego eran difíciles de eliminar, con los altos costos correspondientes para la producción y la purificación de PS (Comfurius P. et al., Journal of Lipid Research 1990, 31:1719-1721) .

Por lo tanto, el solvente orgánico fue sustituido por un detergente/tensoactivo capaz de dispersar el fosfolípido de partida en forma micelar, con el objetivo de realizar la reacción enzimática de síntesis exclusivamente en un medio acuoso.

De hecho, el documento EP 1048738 se refiere a un procedimiento para la síntesis enzimática de PS en un medio acuoso, absolutamente libre de cualquier contaminación por solventes orgánicos, en presencia de concentraciones determinadas de detergentes específicos y sales de calcio.

El documento DE 19917249 describe un procedimiento para la producción enzimática de PS en un medio acuoso sin 2

usar tensoactivos, exclusivamente con la adición de sal de cloruro de calcio (CaCl2) , sin embargo, no se especifican el porcentaje de conversión enzimática y el grado de pureza de la PS obtenida.

El documento EP 1310563 describe un procedimiento para la preparación de PS en una fase acuosa sin usar detergentes y/o sales de calcio, basado en la homogeneización de la mezcla de partida que consiste en fosfolípido, aceptor hidroxi y PLD en agua, para proporcionar un homogeneizado final con una estructura similar a la de una membrana de fosfolípidos bi-laminar en la que, subsiguientemente, puede ocurrir la reacción de transfosfatidilación.

El documento EP 1427839 se describe la síntesis enzimática de fosfolípidos, incluyendo PS, en agua, sin detergentes, pero en presencia de iones metálicos que son liberados desde las sales correspondientes cuando las mismas son preparadas/disueltas en agua. Dicho procedimiento ocurre en dos fases distintas en las que, a partir de mezclas de fosfolípidos, una primera reacción de hidrólisis enzimática es catalizada por PLD para producir ácido fosfatídico, seguido por una segunda reacción de transfosfatidilación, en la que se forma PS en presencia de un exceso de serina.

El documento WO 00/77183 divulga un procedimiento de realización de hidrólisis o transesterificación cataliza por enzimas de un fosfolípido, que comprende disolver dicha enzima en un medio acuoso que contiene (i) una suspensión liposomal de dicho fosfolípido, (ii) un reactivo que contiene hidroxilo, seleccionado de entre agua, un alcohol o un derivado de alcohol, y (iii) cuando se requiera por la enzima, un catión de metal divalente, añadiendo gel de sílice a dicho medio, y agitando la mezcla resultante. Preferentemente, el catión de metal divalente es calcio. Solo se ejemplifica el cloruro de calcio.

Por último, el documento EP 1231213 reivindica un procedimiento para la síntesis enzimática de PS usando, en agua, una fracción de la enzima PLD producida y purificada a partir de la cepa Streptoverticillium hachijoense, para un rendimiento más abundante en la producción final de PS.

En relación a la purificación de PS (obtenida por transfosfatidilación en un medio acuoso/solvente orgánico o en un medio acuoso) , el documento EP 1213294 reivindica un procedimiento de purificación basado en el uso de una mezcla que consiste en agua/solvente orgánico polar (tal como isopropanol) , para extraer el fosfolípido indicado anteriormente de la solución que lo contiene, que a su vez es representada por un solvente hidrocarbonado (tal como tolueno) , mientras que el documento EP 0922707 se refiere a un procedimiento para la extracción/purificación de PS a partir de una mezcla de fosfolípidos, usando un sistema difásico de solventes orgánicos, tales como heptano y metanol.

La presente invención se refiere a procedimientos para la producción y la purificación de la fosfatidilserina (PS) que proporcionan el producto final en un rendimiento muy alto, gracias a una conversión eficiente de PC en PS, por medio de la acción específica de los óxidos de metales bivalentes (BMO) .

Además, el procedimiento de transfosfatidilación catalizado por la enzima PLD, permite que un alto porcentaje de PC sea convertido en PS, independientemente del medio en el que se produce la reacción enzimática.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de PS catalizada por PLD y BMO, cuyo procedimiento se caracteriza porque se realiza en un medio hidroalcohólico que consiste en agua/alcoholes alifáticos, o en un medio aprótico que consiste en agua/solventes apróticos polares, o en un sistema de dos fases que consiste en agua/solventes orgánicos.

Descripción... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de preparación de fosfatidilserina de fórmula en la que R1 y R2 representan, independientemente, un acilo C10-C30, saturado, mono-insaturado o poliinsaturado, X=OH o OM, en la que M = metal alcalino o alcalinotérreo, amonio, alquilamonio (incluyendo la sal interna) , incluyendo la reacción de transfosfatidilación entre un compuesto de la fórmula general en la que R1 y R2 y X tienen los significados especificados anteriormente, R3 = CH2-CH2-NH2 o CH2-CH2-N+ (CH3) 3 y serina en forma D, L o racémica catalizada por la enzima fosfolipasa D (PLD) , caracterizado porque dicha reacción es llevada a cabo en un medio hidroalcohólico que contiene un alcohol alifático y en presencia de óxido de metal bivalente.

2. Procedimiento de preparación de fosfatidilserina de fórmula que incluye la reacción de transfosfatidilación entre un compuesto de fórmula general en la que R1, R2, R3 y X tienen los mismos significados de la reivindicación 1, y serina en forma D, L o racémica catalizada por la enzima fosfolipasa D (PLD) , caracterizado porque dicha reacción ocurre en un medio que contienen un solvente polar aprótico y en presencia de un óxido de metal bivalente.

3. Procedimiento de preparación de fosfatidilserina de fórmula que incluye la reacción de transfosfatidilación entre el compuesto de fórmula general en la que R1, R2, R3 y X tienen los mismos significados de la reivindicación 1, y serina en forma D, L o racémica catalizada por la enzima fosfolipasa D (PLD) , caracterizado porque dicha reacción es realizada en un medio que consiste en un sistema de dos fases formado 20 por agua/solvente orgánico aprótico y en presencia de un óxido de metal bivalente.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los alcoholes alifáticos son seleccionados de entre metanol, etanol, n-propanol, isopropanol.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el alcohol alifático es isopropanol en una concentración entre el 0, 1 y el 50%, expresada como % en volumen, sobre el volumen del tampón de partida.

25 6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la concentración de isopropanol es del 10%.

7. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que los solventes polares apróticos son seleccionados de entre dimetilsulfóxido, acetonitrilo, dimetilformamida y N-metil-pirrolidona.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el solvente polar aprótico es dimetilsulfóxido en una concentración entre el 0, 1 y el 50%, expresada como % en volumen, sobre el volumen del tampón de partida.

30 9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la concentración de dimetilsulfóxido es del 1, 25%.

10. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que los solventes orgánicos son seleccionados de entre nhexano, tolueno, benceno y n-butanol.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el solvente orgánico es n-hexano en una concentración entre el 0, 1 y el 40%, expresada como % en volumen, sobre el volumen del tampón de partida.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la concentración de n-hexano es de 1, 25% ó 2, 5%.

13. Procedimiento según las reivindicaciones anteriores, en el que el óxido de metal bivalente es óxido de calcio o magnesio o zinc, en una concentración de entre 0, 1 y 1M.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la concentración de los óxidos seleccionados es de 0, 33 o 0, 54 M.

15. Procedimiento según las reivindicaciones 1-3, en el que el compuesto es fosfatidilcolina y la concentración de serina está en el intervalo entre 1 y 5 g/g de fosfatidilcolina.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la concentración de serina está en el intervalo entre 2 y 3 g/g de fosfatidilcolina.

17. Procedimiento según las reivindicaciones 1-3, en el que el compuesto es fosfatidilcolina y la fosfatidilcolina es

de origen animal y/o vegetal, natural o sintética, presente en forma purificada o como materia prima, a una concentración inicial de entre 10 y 500 mg/ml, preferentemente entre 200 y 300 mg/ml.

18. Procedimiento según todas las reivindicaciones anteriores, en el que la reacción de transfosfatidilación ocurre a una temperatura de entre 20ºC y 60ºC y, preferentemente, a 45ºC.

19. Procedimiento según todas las reivindicaciones anteriores, en el que la reacción de transfosfatidilación ocurre a 10 una temperatura de entre 20ºC y 60ºC y, preferentemente, a 55ºC.

20. Procedimiento según todas las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima PLD es de origen fermentativo, derivada del microorganismo Streptoverticillium hachijoense, usada en forma purificada, parcialmente purificada o no purificada.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el compuesto es fosfatidilcolina y la concentración de PLD 15 usada varía entre 1 y 100 unidades/g de fosfatidilcolina.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que la concentración de PLD usada varía entre 1 y 10 unidades/g de fosfatidilcolina.

23. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la enzima PLD, derivada del microorganismo Streptoverticillium hachijoense, es purificada siguiendo las etapas siguientes: 20 I) eliminación del agente productor mediante microfiltración con un tamaño de poro de 0, 2 µm; II) ultrafiltración a través de filtros con un corte molecular de 10.000 D;

III) ultrafiltración a través de filtros con membranas con un corte molecular de 300.000 D; IV) ultrafiltración a través de membranas con un corte molecular de 10.000 D para volver a concentrar la enzima y dializarla contra tampón Tris-HCl.