Polipéptidos y polinucleótidos de Porfiromonas gingivalis.

Un polipéptido Porfiromonas gingivalis antigénico aislado, el polipéptido comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 426;

(ii) la secuencia de aminoácidos de los residuos 24 a 821 o 27 a 821 de la SEQ ID NO. 426; o

(iii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 85 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i) .

Polipéptidos y Polinucleótidos de Porfiromonas gingivalis Campo de la invención La presente invención se relaciona con secuencias de nucleótidos p. Gingivalis, polipéptidos p. Gingivalis y sondas para la detección de p. Gingivalis. Los polipéptidos y nucleótidos de p. Gingivalis se pueden utilizar en composiciones para uso en elevar una respuesta inmune en un sujeto contra p. Gingivalis y tratar o evitar o reducir la gravedad de la afección conocida como periodontitis.

Antecedentes de la invención Las enfermedades periodontales son enfermedades inflamatorias asociadas con bacterias de los tejidos de soporte del diente y varían desde la forma relativamente moderada de gingivitis, la inflamación reversible, no específica del tejido gingival hasta las formas más agresivas de periodontitis que se caracterizan por la destrucción de las estructuras de soporte del diente. La periodontitis se asocia con una infección subgingival de asociación de bacterias Gram-negativas específicas que conduce a la destrucción del periodonto y es un gran problema de salud pública. Una bacteria que atrae interés considerable es P. gingivalis cuando la recuperación de este microorganismo a partir de lesiones de periodontitis de adulto puede ser de hasta 50 % de la flora subgingival cultivable anaeróbicamente, mientras que raramente se recupera de P. gingivalis, y luego en bajas cifras, de los sitios saludables. Se ha asociado un aumento proporcional en el nivel de P. gingivalis en la placa subgingival con un aumento grave de periodontitis y erradicación del microorganismo de la población microbiana subgingival cultivable acompañado de resolución de la enfermedad. Se ha demostrado la progresión de las lesiones por periodontitis en primates diferentes a los humanos con la implantación subgingival de P. gingivalis. Estos hallazgos en animales y humanos sugieren una función principal de P. gingivalis en el desarrollo de la periodontitis en adultos.

P. gingivalis es un bacilo Gram-negativo proteolítico, asacarolítico, anaeróbico, pigmentado en negro que obtiene energía del metabolismo de aminoácidos específicos. El microorganismo tiene un requerimiento absoluto de hierro para crecimiento, preferiblemente en la forma de hemo o su Fe (III) .

Con el fin de desarrollar una vacuna segura y eficaz para evitar, eliminar o reducir la colonización por P. gingivalis es necesario identificar y producir antígenos que estén implicados en la virulencia que tengan utilidad como inmunógenos posiblemente a través de la generación de anticuerpos específicos. Aunque es posible intentar aislar los antígenos directamente de los cultivos de P. gingivalis es frecuentemente difícil. Por ejemplo como se mencionó anteriormente, P. gingivalis es un anaerobo estricto y puede ser difícil de aislar y cultivar. También se sabe que, para un número de organismos, cuando son cultivados in vitro que muchos genes de virulencia se regulan por disminución y las proteínas codificadas no se expresan más. Si se aplican técnicas de química convencional para purificación no se pueden identificar los candidatos de vacuna de moléculas potencialmente importantes (protectoras) . Con el secuenciamiento de ADN, cuando está presente el gen (pero no transcrito) aún cuando el organismo se cultiva in vitro se puede identificar, clonar y producir como una proteína de ADN recombinante. De forma similar, se puede expresar transitoriamente un antígeno protector u objetivo terapéutico por el organismo in vitro o producir en bajos niveles que hacen la identificación de estas moléculas extremadamente difíciles mediante métodos convencionales.

Con la identificación serológica de los objetivos terapéuticos uno se limita a aquellas respuestas que son detectables utilizando métodos estándar tales como Western Blot o ELISA. La limitación aquí es el nivel de respuesta que se genera por el animal o humano y determina si esta respuesta es protectora, dañina o irrelevante. No está presente tal limitación con un método de secuenciamiento para la identificación de los objetivos profilácticos o terapéuticos potenciales.

También se sabe que el P. gingivalis produce un rango de proteasas ampliamente activas (University of Melbourne, Solicitud de Patente Internacional No WO97/16542, Patente Estadounidense Nos 5, 475, 097 y 5, 523, 390) , que hace que sea difícil la identificación de las proteínas intactas debido a su degradación por estas proteasas.

Resumen de la invención Los presentes inventores han intentado aislar las secuencias de nucleótidos P. gingivalis que se pueden utilizar para producción recombinante de los polipéptidos P. gingivalis y para desarrollar sondas de nucleótido específicas para P. gingivalis. Las secuencias de ADN mencionadas adelante se han seleccionado de un gran número de secuencias P. gingivalis de acuerdo con su potencial indicador como candidatos de vacuna. Esta etapa intuitiva implica la comparación desde la secuencia de proteína deducida de las secuencias de ADN P. gingivalis hasta las bases de datos de secuencia de proteínas conocidas. Algunas de las características utilizadas para seleccionar los candidatos de vacuna útiles incluyen; la ubicación celular esperada, tal como proteínas de membrana externas o proteínas secretadas, las actividades funcionales particulares de proteínas similares tales como aquellas con una actividad enzimática o proteolítica, las proteínas implicadas en las rutas metabólicas esenciales que cuando se inactivan o bloquean pueden ser perjudiciales o letales para el organismo, las proteínas que se pueden esperar que cumplan una función en la patogenia del organismo por ejemplo lisis de glóbulos rojos, aglutinación celular o receptores celulares y proteínas que son parálogas a las proteínas con eficacia de vacuna mejorada.

En un primer aspecto la presente invención proporciona un polipéptido Porfiromonas gingivalis antigénico aislado, el polipéptido comprende;

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 426;

(ii) la secuencia de aminoácidos de los residuos 24 a 821 o 27 a 821 de la SEQ ID NO. 426; o

(iii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 85 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i) .

En una realización de la presente invención, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la (i) .

Como se utiliza aquí el % de identidad para los polipéptidos se calcula utilizando el algoritmo de alineación de Needleman y Munsch (9) utilizando una matriz de clasificación de proteína estándar (Blosum 50) .

En una realización preferida de la presente invención el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ. ID. NO. 426 o SEQ ID NO. 301.

En un segundo aspecto la presente invención proporciona una molécula de ADN aislada, la molécula de ADN 15 comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido del primer aspecto de la presente invención.

Se prefiere que la molécula de ADN aislada comprenda la secuencia de nucleótido de la SEQ. ID. NO. 162 o SEQ ID NO. 37.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN del segundo aspecto de la presente invención ligada operablemente a un elemento regulador de transcripción.

La presente invención también proporciona una célula aislada que comprende este vector de expresión recombinante.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido P. gingivalis que comprende cultivar la célula bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido.

En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad efectiva de (a) por lo menos un polipéptido del primer aspecto de la presente invención, (b) por lo menos una molécula de ADN del segundo aspecto de la presente invención, y/o (c) un polipéptido de por lo menos 40 aminoácidos que tiene una secuencia contigua de por lo menos 40 aminoácidos idénticos a una secuencia de aminoácidos contigua de la SEQ ID NO. 426, en donde el polipéptido es capaz de elevar una respuesta inmune contra P. gingivalis, y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea un adyuvante. En otros aspectos, la presente invención proporciona tal composición para uso en elevar una respuesta inmune... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido Porfiromonas gingivalis antigénico aislado, el polipéptido comprende:

(i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 426;

(ii) la secuencia de aminoácidos de los residuos 24 a 821 o 27 a 821 de la SEQ ID NO. 426; o

(iii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 85 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i) .

2. Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de (i) .

3. Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO. 426.

4. Una molécula de ADN aislada, la molécula de ADN comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3.

5. Una molécula de ADN aislada como se reivindica en la reivindicación 4 en la que la molécula de ADN comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO. 162.

6. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 o reivindicación 5 ligada operativamente a un elemento regulador de transcripción.

7. Una célula aislada que comprende el vector de expresión recombinante como se reivindica en la reivindicación 6.

8. Un método para producir un polipéptido P. gingivalis que comprende cultivar la célula como se reivindica en la reivindicación 7 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido.

9. Una composición farmacéutica que comprende:

(i) una cantidad efectiva de (a) por lo menos un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3, (b) por lo menos una molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 o reivindicación 5, y/o (c) un polipéptido de por lo menos 40 aminoácidos que tiene una secuencia contigua de por lo menos 40 aminoácidos idénticos a una secuencia de aminoácidos contigua de la SEQ ID NO. 426, en donde el polipéptido es capaz de elevar una respuesta inmune contra P. gingivalis; y

(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.

10. Una composición como se reivindica en la reivindicación 9 o reivindicación 10 en la que el portador farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.

11. Una composición como se reivindica en la reivindicación 9 o reivindicación 10 para uso en elevar una respuesta inmune dirigida a P. gingivalis en un sujeto.

12. Una composición para uso como se reivindica en la reivindicación 11 para tratar un sujeto para infección P. gingivalis.

13. Una composición para uso como se reivindica en la reivindicación 12, en donde el tratamiento es un tratamiento profiláctico o un tratamiento terapéutico.

14. Un anticuerpo elevado contra un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1, 2 o 3.

15. Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 14 en el que el anticuerpo es policlonal o monoclonal.

16. Una composición que comprende por lo menos un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 14 o reivindicación 15.

17. Una composición como se reivindica en la reivindicación 16 que se adapta para uso oral.

18. Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 en una muestra que comprende:

(a) poner en contacto una muestra con la sonda de nucleótido que comprende por lo menos 18 nucleótidos y que tiene una secuencia contigua de por lo menos 18 nucleótidos idénticos a una secuencia de nucleótido contigua de la SEQ ID NO. 37 bajo condiciones en las que se puede formar un híbrido entre la sonda y la molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 en la muestra; y

(b) detectar el híbrido formado en la etapa (a) , en donde la detección de un híbrido indica la presencia de la molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 4 en la muestra.