Pili de tipo IV de la Haemophilus influenzae.

Proteína de fusión que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquierade entre:

(a) polipéptido PilA SEC ID nº 2,

(b) polipéptido PilA SEC ID nº 26,

(c) polipéptido PilA SEC ID nº 28,

(d) polipéptido PilA SEC ID nº 30,

(e) polipéptido PilA SEC ID nº 32,

(f) polipéptido PilA SEC ID nº 34,

(g) polipéptido PilA SEC ID nº 36,

(h) polipéptido PilA SEC ID nº 38,

(i) polipéptido PilA SEC ID nº 40,

(j) polipéptido PilA SEC ID nº 42,

(k) polipéptido PilA SEC ID nº 44,

(l) un fragmento de cualquiera de entre (a)-(k) que induce un respuesta inmunológica al polipéptido pilina de H.influenzae,

(m) un fragmento de cualquiera de entre (a)-(k) que inhibe la adherencia celular de H. influenzae,

(n) los aminoácidos 35 a 68 de SEC ID nº: 2,

(o) los aminoácidos 69 a 102 de SEC ID nº: 2,

(p) los aminoácidos 103 a 137 de SEC ID nº 2, o

(q) los aminoácidos 21 a 35 de SEC ID nº 2.

Pili de tipo IV de la Haemophilus influenzae.

Campo de la invención

La invención descrita en la presente memoria se refiere a un regulón de Haemophilus influenzae (H. influenzae) codificante de pili de tipo IV. En particular, la invención se refiere a pili de tipo IV procedentes de H. influenzae no tipable (NTHi) y de las cepas a, b, c, e y f de H. influenzae. La invención proporciona poinucleótidos aislados de pilus de H. influenzae y polipéptidos codificados por los polinucleótidos, así como polinucleótidos y polipéptidos codificados por los polinucleótidos implicados en el ensamblaje/desensamblaje de la estructura. La invención se refiere asimismo a usos de dichos polinucleótidos y/o polipéptidos, incluyendo procedimientos para inducir una respuesta inmunológica frente a H. influenzae y a procedimientos de tratamiento y prevención de afecciones patológicas relacionadas con H. influenzae.

Antecedentes

El término clínico para infecciones del oído medio es otitis media (OM) . Según Klein, Vaccine 19 (supl. 1) :S2-S8, 2000, la OM es el motivo más común de que un niño enfermo obtenga cuidados sanitarios, y de que en Estados Unidos un niño reciba antibióticos o deba someterse a anestesia general. La estadística indica que en 1990 se realizaron 24, 5 millones de visitas médicas por OM, representando un incremento superior a 200% respecto a los números de visitas informados durante la década de los 80. Aunque raramente se asocia a mortalidad, la morbilidad asociada a la OM es significativa. La pérdida de audición es un problema común asociado a esta enfermedad, que con frecuencia afecta al comportamiento del niño, a su educación y al desarrollo de habilidades del lenguaje (Baldwin, Am. J. Otol. 14:601-604, 1993; Hunter et al., Ann. Otol. Rhinol. Lar y ngol. supl. 163:59-61, 1994; Teele et al., J. Infect. Dis. 162:685-694, 1990) . El impacto socioeconómico de la OM también es grande, con costes directos e indirectos derivados del diagnóstico y del control de la OM superiores a 5.000 millones de dólares al año sólo en Estados Unidos (Kaplan et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 16:S9-11, 1997) .

Se cree que la OM es el resultado de factores infecciosos, ambientales y la genética del huésped. Algunas bacterias, tales como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis son los organismos infecciosos más comunes en la OM. La OM aguda es una enfermedad caracterizada por la rápida aparición y corta duración de indicios y síntomas de inflamación en el oído medio, mientras que la OM crónica se refiere a una afección que se define por la presencia relativamente asintomática de líquido (o efusión) en el oído medio. Sin embargo, en la OM crónica, a pesar de la ausencia de determinados indicios de infección aguda (es decir, dolor del oído, o fiebre) , estos líquidos anormales en el oído medio pueden persistir durante periodos superiores a tres meses. El tratamiento de la OM aguda mediante terapia de antibióticos es común, aunque han surgido bacterias resistentes a los antibióticos. El control quirúrgico de la OM crónica implica la inserción de tubos de timpanostomía a través de la membrana timpánica del oído con el niño bajo anestesia general. Aunque este procedimiento es común (las tasas de prevalencia son de ~13%; Bright et al., Am. J. Public Health 83 (7) :1026-8, 1993) y resulta altamente efectivo en términos de alivio de síntomas dolorosos por el drenaje de líquidos acumulados en el oído medio, es invasivo y comporta riesgos (Berman et al., Pediatrics 93 (3) :353-63 1994; Bright et al., supra; Cimons, ASM News 60:527-528; Paap, Ann. Pharmacother. 30 (11) :1291-7, 1996) . De esta manera, existe una necesidad de enfoques adicionales del control y, preferentemente, de la prevención, de la OM.

El desarrollo de una vacuna para la OM ha avanzado más para S. pneumoniae, el agente causativo principal de la OM aguda (AOM) , tal como pone de manifiesto en la reciente autorización y liberación de una vacuna de conjugado capsular heptavalente, PREVNAR® (Eskola y Kilpi, Pediatr. Infect. Dis. J. 16:S72-78, 2000) . Aunque PREVNAR® ha resultado altamente eficaz para la enfermedad neumocócica invasiva, la cobertura de la OM ha sido decepcionante (6% a 8%) , con informes de un número incrementado de casos de OM debido a serotipos no incluidos en la vacuna (Black et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 19:187-195, 2000; Eskola et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 19:S72-78, 2000; Eskola et al., N. Engl. J. Med. 344:403-409, 2001; Snow et al., Otol. Neurotol. 23:1-2, 2002) .

H. influenzae es una bacteria Gram-negativa que, tal como se ha indicado anteriormente, desempeña un papel en la OM. Los aislados clínicos de H. influenzae se clasifican en los serotipos "a" a "f", o como no tipable, dependiendo de la presencia o ausencia, respectivamente, de cápsulas polisacáridas específicas de tipo sobre la bacteria. Se ha desarrollado vacuna para la H. influenzae de tipo b. Al igual que Prevnar®, las vacunas de H. influenzae tipo b presentan como diana la cápsula polisacárida de este organismo y, de esta manera, la vacuna comprende el polisacárido de la cápsula que se ha conjugado con una proteína portadora. Se han realizado menos avances hacia una vacuna de H. influenzae no tipable (NTHi) , que provoca aproximadamente el 20% de las OM agudas en niños y predomina en la OM crónica con efusión (Coleman et al., Inf. and Immunity 59 (5) :1716-1722, 1991; Klein, Pediatr. Infect. Dis. J. 16:S5-8, 1997; Spinola et al., J. Infect. Dis. 154:100-109, 1986) . La NTHi también puede provocar neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, meningitis, infecciones postparto y neonatales, sepsis postparto y neonatal, salpingitis aguda y crónica, epiglotis, pericarditis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección del tracto urinario, mastoiditis, infección del injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre purpúrica brasileña, bacteremia oculta y la exacerbación de enfermedades pulmonares

subyacentes, tales como bronquitis crónica, bronquiectasia y fibrosis quística. Un aislado prototipo de NTHi es el aislado de bajo número de pases 86-028NP recuperado de un niño que presentaba OM crónica. Esta cepa ha sido bien caracterizada in vitro (Bakaletz et al., Infect. Immun. 53:331-5, 1988; Holmes et al., Microb. Pathog. 23:157-66, 1997) , así como en un modelo de chinchilla de la OM (Bakaletz et al., Vaccine 15:955-61, 1997; Suzuki et al., Infect. Immun. 62:1710-8, 1994; DeMaria et al., Infect. Immun. 64:5187-92, 1996) . La cepa de NTHi 86-026NP se depositó en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, el 16 de octubre de 2001, y recibió el nº de acceso PTA-4764. Puede encontrarse un juego de cóntigos del genoma de la cepa 86-028NP en http://www.microbial-pathogenesis.org.

La adherencia y la colonización se acepta que son las primeras etapas de la patogénesis de H. influenzae. Como tales, H. influenzae expresa múltiples adhesinas, incluyendo pili hemaglutinantes, fimbrias y adhesinas no fimbriales (Gilsdorf et al., Pediatr. Res. 39:343-348, 1996; Gilsdorf, Infect. Immun. 65:2997-3002, 1997, y St. Geme III, Cell. Microbiol. 4:191-200, 2002) . Notablemente, ninguna de estas adhesinas descritas se ha asociado anteriormente a una función de motilidad. Además, H. influenzae no expresa flagelos, que también se asocian a la motilidad. La motilidad espasmódica es un forma independiente de flagelos de traslocación bacteriana sobre superficies húmedas y se produce mediante extensión, enganche y posteriormente retracción de estructuras polares conocidas como pili de tipo IV (Bardy, Microbiology 149:295-304, 2003; Tonjum y Koomey, Gene 192:155-163, 1997; Wolfgang et al., EMBO J. 19:6408-6418; Mattick, Annu. Rev. Microbiol. 56:289-314, 2002) . Los pili tipo IV típicamente presentan 5 a 7 nm de diámetro, varios micrómetros de longitud y están comprendidos de una única subunidad proteica ensamblada en una conformación helicoidal con 5 subunidades por giro (Bardy et al., Microbiology 149:295-304, 2003; Wall y Kaiser, Mol. Microbiol. 32:1-10, 1999) . Las subunidades de pilina de tipo IV habitualmente presentan una longitud de entre 145 y 160 aminoácidos y pueden encontrarse glucosiladas o fosforiladas. Existen dos clases de subunidades de pilina, de tipo IVa y de tipo IVb, que se distinguen entre sí por la longitud media del péptido líder y de la subunidad madura, en la que el aminoácido N-metilado ocupa la posición N-terminal de la proteína madura, y la longitud media de la región D (por región disulfuro) . La mayoría... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de entre:

(a) polipéptido PilA SEC ID nº 2,

(b) polipéptido PilA SEC ID nº 26,

(c) polipéptido PilA SEC ID nº 28,

(d) polipéptido PilA SEC ID nº 30,

(e) polipéptido PilA SEC ID nº 32,

(f) polipéptido PilA SEC ID nº 34,

(g) polipéptido PilA SEC ID nº 36,

(h) polipéptido PilA SEC ID nº 38,

(i) polipéptido PilA SEC ID nº 40,

(j) polipéptido PilA SEC ID nº 42,

(k) polipéptido PilA SEC ID nº 44,

(l) un fragmento de cualquiera de entre (a) - (k) que induce un respuesta inmunológica al polipéptido pilina de H.

influenzae, (m) un fragmento de cualquiera de entre (a) - (k) que inhibe la adherencia celular de H. influenzae,

(n) los aminoácidos 35 a 68 de SEC ID nº: 2,

(o) los aminoácidos 69 a 102 de SEC ID nº: 2,

(p) los aminoácidos 103 a 137 de SEC ID nº 2, o

(q) los aminoácidos 21 a 35 de SEC ID nº 2.

2. Secuencia de polinucleótido aislado que codifica una proteína de fusión según la reivindicación 1.

3. Vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 2.

4. Composición que comprende una proteína de fusión según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que la composición se formula para una vía de administración seleccionada de entre el grupo constituido por las administraciones parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, rectal, intranasal, transdérmica, subcutánea, intramuscular o vaginal.

6. Utilización de una o más proteínas de fusión según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado a la inducción de una respuesta inmunológica a las bacterias NTHi.

7. Utilización de uno o más polinucleótidos según la reivindicación 2, para la preparación de un medicamento destinado a la inducción de una respuesta inmunológica a las bacterias NTHi.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que el polinucleótido se encuentra en un vector plásmido o virus.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que el medicamento se formula para una vía de administración seleccionada de entre el grupo constituido por las administraciones parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, rectal, intranasal, transdérmica, subcutánea, intramuscular o vaginal.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que la infección bacteriana por NTHi implica una afección patológica seleccionada de entre el grupo constituido por otitis media, neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, meningitis, sepsis puerperal, sepsis neonatal, salpingitis, epiglotis, pericarditis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección del tracto urinario, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre purpúrica brasileña, bacteremia oculta, bronquitis crónica, bronquiectasia y fibrosis quística.

11. Proteína de fusión según la reivindicación 1, para su utilización en la inducción de una respuesta inmunológica a las bacterias NTHi.

12. Polinucleótido según la reivindicación 2, para su utilización en la inducción de una respuesta inmunológica a las bacterias NTHi.

13. Polinucleótido según la reivindicación 12, en el que el polinucleótido se encuentra en un plásmido o en un vector viral.

14. Proteína de fusión o polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en los que la infección bacteriana por NTHi implica una afección patológica seleccionada de entre el grupo constituido por otitis media, neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, meningitis, sepsis puerperal, sepsis

neonatal, salpingitis, epiglotis, pericarditis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección del tracto urinario, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre purpúrica brasileña, bacteremia oculta, bronquitis crónica, bronquiectasia y fibrosis quística.