PÉPTIDOS CAPACES DE INHIBIR LA INTERACCIÓN ENTRE LAS PRESENILINAS Y EL PÉPTIDO BETA-AMILOIDE O SU PRECURSOR.

Péptidos capaces de inhibir la interacción entre las presenilinas y el péptido beta-amiloide o su precursor. La presente invención se refiere a la elaboración de ensayos in vitro para poner de manifiesto moléculas y en particular pequeñas moléculas capaces de inhibir la interacción entre APP y el extremo N-Terminal de las Presenilinas. El péptido amiloide Aß, de 37 a 42 aminoácidos, es el principal componente proteico de las placas seniles características de la enfermedad de Alzheimer. Este péptido es producido por división de su precursor, la proteína precursora del péptido amiloide (APP). Las mutaciones en el gen del APP son responsables de ciertas formas familiares precoces de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, la mayoría de estas formas están asociadas a la presencia de mutaciones en dos genes, presenilinas PS1 (inicialmente denominado S182) y PS2 (inicialmente STM2), recientemente identificados por clonación posicional (Hardy, 1.997). Estas formas son dominantes y estas anomalías corresponden todas a mutaciones de sentido falso a excepción de una convicción la deleción de un exón. Las presenilinas son proteínas hidrófobas de membrana de aproximadamente 45-50 kDa de masa molecular y que presentan el 67% de identidad entre ellas. Son homólogas a dos proteínas de C. elegans, SPE4 y Sel-12, que están implicadas de manera indirecta respectivamente en el transporte intracelular y en la señalización de los receptores Notch. Sin embargo, la función fisiológica de las presenilinas aún se desconoce. La implicación en la enfermedad de Alzheimer, las dos proteínas aunque vecinas, permiten pensar que las presenilinas contribuyen a una vía fisiológica esencial en la etiología de esta patología. La proteína PS1 comprende 467 aminoácidos y PS2 448. Las dos presentan la estructura de una proteína de membrana con 6 a 8 dominios transmembrana potenciales. Cada una de estas presenilinas está sujeta in vivo a una división proteolítica precisa que da como resultado dos fragmentos denominados generalmente fragmentos N(amino)- y C(carboxi)-terminales (Thinakaran et col., 1.996). Esta división ha sido cartografiada entre los restos 291 y 299 de PS1 (Podlisny et col., 1.997) y en una región homóloga de PS2. En general se entiende por fragmento Nterminal (N-ter), el fragmento de la posición 1 a aproximadamente 291 de PS1 y por fragmento C-terminal, el complemento. Aunque la topología exacta de las presenilinas en las membranas lipídicas no está claramente establecida, se ha propuesto que sus extremos N- y C-terminales [RC1], así como el gran bucle hidrófilo, están presentes en el compartimento citosólico (Doan et col, 1.996, véase el esquema de la figura 1). Ahora se ha demostrado que las formas mutadas de las presenilinas inducen el aumento de la producción del péptido amiloide largo Aß 1-42 con respecto al Aß 1-40 tanto en los pacientes portadores (Scheuner et coll., 1.996), como en células transinfectadas (Borchelt et coll., 1.996) o en ratones transgénicos (Duff et coll: 1.996). El péptido amiloide Aß, que forma las placas seniles, lesiones características de la patología, y sus diferentes formas proceden del catabolismo de la proteína precursora del amiloide, APP. En particular, se han descrito dos formas esenciales del péptido amiloide, una de cuarenta restos, Aß40, y la otra poseyendo dos restos suplementarios en su carboxi terminal, Aß42. In vitro, el péptido Aß presenta fuertes propiedades de agregación que aumentan para la forma Aß42 y esta última parece formar efectivamente los primeros agregados detectables en la patología. Por otro lado, la forma Aß42 es producida específicamente después de traumatismo craneano en el hombre, lo que constituye uno de los factores de riesgo medioambientales mejor establecidos de la enfermedad de Alzheimer. Además, las formas genéticas precoces de la enfermedad asociadas a las mutaciones tanto en APP (hay seis) como ahora en las presenilinas 1 y 2, concurren todas en un aumento de la relación Aß42/Aß40. El conjunto de estos factores parece designar el Aß42 como el agente clave de la patología tanto en las formas genéticas como esporádicas de la enfermedad y la elucidación de su mecanismo de formación se ha vuelto una cuestión fundamental. Con respecto a esto, se ha indicado la formación de complejo en la misma envoltura celular entre el precursor del péptido ß-amiloide y PS1 o PS2 (Weidemann et al. 1.997, Xia et al., 1.997) sin embargo no se conoce la naturaleza precisa de los casos responsables de la producción del péptido ß-amiloide y aún no se ha podido establecer ninguna relación entre el posible papel de estos complejos y la producción del péptido ß-amiloide Aß42. Es importante sin embargo señalar que el péptido Aß42, pero no el Aß40, parece estar localizado en el retículo endoplasmático en las células neuronales (Hartmann et al., 1.997). La presente invención resulta de la identificación y caracterización por la solicitante de regiones particulares de la presenilina 1 (PS1) y la presenilina 2 (PS2), así como regiones particulares del precursor del péptido ß-amiloide (APP) implicadas en la formación de los complejos APP/PS1 y APP/PS2. La presente invención deriva en particular de la evidencia de la capacidad de la región N-terminal hidrófila (aminoácidos 1-87) de la PS2 para reconocer diferentes dominios de APP. Deriva además de la evidencia de propiedades similares para la región N-terminal de PS1 (fragmento 1-213). Resulta igualmente de la demostración de la capacidad de los polipéptidos procedentes de las regiones de las presenilinas definidas anteriormente para inhibir la formación de los complejos entre APP y las presenilinas. Las presenilinas de la presente solicitud corresponden esencialmente a la presenilina 1 (PS1) y/o a la presenilina 2 (PS2). La presente invención resulta además de la evidencia de la localización celular particular, no esperada, de las regiones en interacción con respecto a la membrana lipídica. Resulta más en particular del hecho de que estas 2   interacciones pueden tener lugar no solamente al nivel de membrana sino igualmente al nivel de la luz del retículo endoplasmático y en el compartimento extracelular. Esto es inesperado en la medida en que la región N-terminal de PS (implicada en la interacción) está considerada en general como que está localizada en el citoplasma en las condiciones estándar. La caracterización de los dominios de interacción del APP y las presenilinas y la puesta en evidencia de las diferentes localizaciones celulares de estas interacciones permiten considerar la preparación de nuevos polipéptidos utilizables farmacéuticamente. Un primer objeto de la invención se refiere a un procedimiento de puesta en evidencia o inclinación de compuestos destinados al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende al menos una etapa de detección de la inhibición de la interacción entre el APP y un péptido que comprende la secuencia de los aminoácidos 1 a 213 de PS1 o la secuencia de aminoácidos 1 a 87 de PS2. En el sentido de poder inhibir la interacción, se entiende que la presencia de polipéptidos de la invención y/o los ligandos y/o moléculas puestas en evidencia con ayuda del procedimiento de la invención, basta para inhibir al menos parcialmente dicha interacción entre una presenilina y/o su extremo N-Terminal y el precursor del péptido ßamiloide y/o el péptido ß-amiloide y preferiblemente el péptido Aß1. 12. Se demuestra en los ejemplos de la presente solicitud que la inhibición de esta interacción con uno de los polipéptidos de la invención, conduce a la disminución de la producción del péptido amiloide intracelular Aß1-12. Esta consecuencia funcional está considerada pues para todo polipéptido de la invención y/o ligandos y/o moléculas puestas en evidencia con ayuda del procedimiento de la invención. Inhibir esta interacción y por tanto inhibir la producción de Aß1-12, representa por consiguiente un blanco terapéutico de elección en las enfermedades que implican esta forma de péptido amiloide. Según un modo particular, los polipéptidos puestos en evidencia por la invención comprenden al menos una parte de la presenilina 2 (PS2) permitiendo la interacción con el precursor del péptido ß-amiloide y/o el péptido ß-amiloide. De manera preferida, los polipéptidos se caracterizan por que la parte de PS2 corresponde al fragmento N-terminal hidrófilo de PS2. Más preferiblemente, los polipéptidos comprenden toda o parte de la secuencia que corresponde a la secuencia SEC ID N°1 o una secuencia derivada de ésta. Según otro modo de realización, los polipéptidos puestos en evidencia por la invención comprenden al menos una parte PS1 que permite la interacción con el precursor del péptido ß-amiloide y/o el péptido ß-amiloide. Más preferiblemente,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para poner en evidencia o para aislamiento de compuestos destinados al tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, que comprende al menos una etapa de detección de la inhibición de la interacción entre el APP y un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 1 a 213 de PS1 o la secuencia de aminoácidos 1 a 87 de PS2. 2. Procedimiento para poner en evidencia o para aislamiento de compuestos capaces de inhibir al menos en parte la interacción entre una presenilina y el péptido ß-amiloide, caracterizado por que comprende al menos una etapa de marcado de las presenilinas o los fragmentos de las mismas y una etapa de detección de la inhibición de la interacción entre el péptido Aß1-42 y el extremo N-terminal de las presenilinas. 3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que la presenilina es PS2. 4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el extremo N-terminal de la presenilina es la parte 1-87 de la PS2. 5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado por que comprende las etapas siguientes: - el péptido Aß1-42 es absorbido previamente sobre una membrana de nitrocelulosa por incubación. - se añade un extracto bacteriano que contiene todo o parte de una presenilina para incubación con la molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas para ensayar - la interacción de la presenilina con el péptido Aß1-42 sobre el filtro de nitrocelulosa se pone en evidencia con ayuda de proteínas marcadoras de las presenilinas. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que una de las proteínas marcadoras es la proteína fijadora de la etiqueta-S, acoplada a la fosfatasa alcalina. 29     31   32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   44     46   47   48   49