Procedimiento de panning en fase en solución usando proteínas señuelo modificadas por ingeniería genética.
Un procedimiento para identificar un anticuerpo que se une a un epítopo preseleccionado de una proteína dianaque comprende:
a) proporcionar una biblioteca de partículas de fago que exprese anticuerpos sobre la superficie de laspartículas de fago;
b) preparar una proteína señuelo que tenga cambios en las secuencias de aminoácidos correspondientes alepítopo preseleccionado de la proteína diana, y difiriendo la proteína señuelo de la proteína diana solo en elepítopo preseleccionado;
c) incubar la biblioteca de partículas de fago con la proteína diana para seleccionar partículas de fago conanticuerpos que se unen a la proteína diana;
d) añadir la proteína señuelo como un competidor a una concentración en exceso molar para seleccionarnegativamente las partículas de fago específicas para el epítopo preseleccionado;
e) separar las partículas de fago que se unan a la proteína diana de las que se unan a la proteína señuelo y
f) recuperar las partículas de fago unidas a la proteína diana.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/013857.
Solicitante: Janssen Biotech, Inc.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 800/850 RIDGEVIEW DRIVE HORSHAM, PA 19044 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: HEAVNER, GEORGE, O\'NEIL,Karyn, SWEET,RAYMOND.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K16/00 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
- C07K16/24 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra citoquinas, linfoquinas o interferones.
- C07K16/36 C07K 16/00 […] › contra factores de coagulación sanguínea.
PDF original: ES-2391097_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento de panning en fase en solución usando proteínas señuelo modificadas por ingeniería genética
Antecedentes de la invención
Técnica relacionada
En la era postgenómica, actualmente pueden enfocarse esfuerzos en el desarrollo de fármacos sobre procedimientos de investigación para bloquear específicamente la función de proteínas clave previamente identificadas por técnicas tales como análisis en micromatrices de niveles de expresión de ARNm en patologías. La proteómica es la nueva ciencia que abarca la comprensión del modo en el que las proteínas interaccionan entre sí tanto en rutas coordinadas como compañeras de unión. La relación de la actividad estructural de las proteínas incluye el mapeo de dominios comunes y la identificación de conformaciones tridimensionales responsables de las funciones. El acceso a la información tridimensional (3D) sobre las proteínas también se ha convertido en rutina. Por ejemplo el NCBI (por las siglas en inglés, National Center for Biotechnology Information, Centro Nacional de Información Biotecnológica) mantiene acceso público a una herramienta denominada VAST que es un servicio de búsqueda de similitud estructura-estructura. Esta herramienta compara coordenadas 3D de una estructura de proteína recientemente determinada con las que se encuentran en la base de datos de modelado molecular (BDMM) y en la base de datos de proteínas (BDP) .
La tecnología de presentación de fagos describe una técnica de selección in vitro en la que la secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido o una proteína está genéticamente fusionada con una proteína de cubierta de un bacteriófago, dando como resultado la presentación de la proteína fusionada en el exterior del virión del fago, mientras que el ADN que la fusión reside dentro del virión. Esta unión física entre la proteína presentada y el ADN que la codifica permite explorar un gran número de variantes de la proteína, cada una unida a su secuencia de ADN correspondiente, mediante un procedimiento de selección sencillo realizado in vitro denominado “bioselección".
Las bibliotecas de presentación de fagos, ribosomas, levaduras y bacterias son herramientas de consulta de grandes cantidades de proteínas o péptidos. La presentación de ribosomas es un procedimiento de traducción de los ARNm en sus proteínas afines conservando al mismo tiempo la proteína unida al ARN. La secuencia codificante de ácido nucleico se recupera por RT-PCR (Mattheakis, L. C. y col. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022) . La presentación de levaduras se basa en la construcción de proteínas de fusión de los receptores de adhesión de aglutinina alfa de levadura asociados a membrana, aga1 y aga2, una parte del sistema de tipo apareamiento (Broder, y col. 1997. Nature Biotechnology, 15: 553-7) . La presentación de bacterias se basa en la fusión de la diana a proteínas bacterianas exportadas que se asocian con la membrana celular o con la pared celular (Chen y Georgiou. 2002. Biotechnol Bioeng, 79: 496-503) .
En comparación con la tecnología del hibridoma, los procedimientos de presentación de fagos y otros anticuerpos permiten la oportunidad de manipular la selección contra el antígeno diana in vitro y sin la limitación de la posibilidad de incidir en huéspedes sobre el antígeno o viceversa. Una ventaja particular de los procedimientos de selección in vitro es la capacidad de manipular procedimientos de selección para obtener anticuerpos que se unan a diversos sitios sobre la proteína diana.
Aunque las fagotecas simplifican la recuperación de material genético asociado con atributos funcionales, se requieren estrategias de selección multietapa para aislar el mejor candidato de la fagoteca. Por otro lado, en aquellos casos en los que se conoce la información estructural en lo que respecta al dominio funcional de un ligando polipeptídico, sería deseable tener un procedimiento de selección de anticuerpos u otros compañeros de unión tales como péptidos o proteínas que se uniesen a un ligando en dominios específicos definidos. Las selecciones dirigidas a dominios o a epítopos se han convertido en un modo rutinario de selección de anticuerpos que se unen a una proteína diana. Tales selecciones se han conseguido empleando principalmente una selección de anticuerpos por etapas utilizando procedimientos diversamente conocidos como panning selectivo, panning deselectivo, captura de ligandos, panning sustractivo o selección por exploración (Hoogenboom, H. R. y col (2000) citado anteriormente) .
En el panning sustractivo, para deseleccionar ligandos de unión no deseados, puede usarse una diana (o dianas) con solapamiento aunque en sitios de unión no completamente idénticos. Esta estrategia se ha usado para identificar ligandos de unión incluso a antígenos desconocidos como en el uso de células normales para deseleccionar ligandos de unión a células cancerosas. Como alternativa, se usan proteínas de origen natural con algunos dominios o estructuras comunes en la selección secuencial o competitiva para obtener anticuerpos de unión a sitios que difieren o que son comunes entre los antígenos relacionados. Típicamente, estos estudios han utilizado proteínas de origen natural tales como quimiocinas relacionadas o proteínas H-ras mutantes (Horn, I. R. y col. 1999, FEBS Lett. 463: 115-120) .
El panning dirigido a la captura de ligandos es análogo a un ensayo ELISA de tipo sándwich en el que se usa un anticuerpo inmovilizado para un epítopo irrelevante y no adyacente para capturar y presentar la cara de unión preferida del ligando diana para el panning de fagos (documento US6376170) . Otros investigadores han usado anticuerpos competitivos para ocultar selectivamente el antígeno en otro dominio que el dominio diana deseado (Tsui, P. y col. 2002. J. Immunol. Meth. 263: 123-132) . La tecnología de exploración utiliza anticuerpos monoclonales
y policlonales, así como ligandos naturales conjugados directa o indirectamente a peroxidasa de rábano picante (HRP) . En presencia de biotina-tiramina estas moléculas catalizan la biotinilación de fagos de unión en estrecha proximidad con el antígeno diana, permitiendo la recuperación específica del fago 'marcado' de la población total usando estreptavidina. De esta manera, el fago de unión a la propia diana, o en su inmediata proximidad, se recupera selectivamente (Osbom, J. K. y col. 1998. Immunotechnol. 3: 293-302) . El uso de anticuerpos monoclonales para dirigir la unión en sitios alternativos también se ha denominado “epítopo caminante” (Osbom, J.
K. y col. 1998. citado anteriormente) . Burioni y col. 1998. Research in virology 5: 327-330, Zhou y col. 2002, PNAS.
99: 5241-5246 y Parsons y col. 1996. Prot. Eng. 9: 1043-1049 desvelan procedimientos de selección negativa.
Estos procedimientos presentan el inconveniente de que un esfuerzo total dirigido para obtener y caracterizar un compañero de unión no deseable debe preceder al esfuerzo de obtener un compañero de unión para el dominio deseado y que no esté dirigida un epítopo específico. La presente invención proporciona un nuevo procedimiento para obtener anticuerpos o compañeros de unión a ligando que se unen a un epítopo seleccionado incorporando una proteína competidora híbrida en el proceso de panning.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un nuevo procedimiento para seleccionar compañeros de unión a ligando que se unen a un dominio preseleccionado usando un ligando señuelo modificado por ingeniería genética en el proceso de panning de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. El ligando señuelo se diseña para diferenciarlo de la proteína diana solo en el domino preseleccionado que constituye el supuesto sitio de unión. El diseño de la proteína señuelo puede basarse en información estructural derivada de mediciones reales, por ejemplo datos cristalográficos por rayos X, o el diseño puede basarse en información realizada por ordenador (in sílico) , datos de estructuras tridimensionales generados por modelado informático. Cuando se dispone de información estructural, el diseño de la proteína señuelo se simplifica. Cuando, para crear un señuelo, no se dispone de información estructural o esta es incompleta, la modificación de regiones distintas de la secuencia puede basarse en variantes naturales, tales como homólogos de especies.
En el presente documento se desvelan ácidos nucleicos que codifican las proteínas señuelo de la... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para identificar un anticuerpo que se une a un epítopo preseleccionado de una proteína diana que comprende:
a) proporcionar una biblioteca de partículas de fago que exprese anticuerpos sobre la superficie de las
partículas de fago; b) preparar una proteína señuelo que tenga cambios en las secuencias de aminoácidos correspondientes al epítopo preseleccionado de la proteína diana, y difiriendo la proteína señuelo de la proteína diana solo en el epítopo preseleccionado; c) incubar la biblioteca de partículas de fago con la proteína diana para seleccionar partículas de fago con
anticuerpos que se unen a la proteína diana; d) añadir la proteína señuelo como un competidor a una concentración en exceso molar para seleccionar negativamente las partículas de fago específicas para el epítopo preseleccionado; e) separar las partículas de fago que se unan a la proteína diana de las que se unan a la proteína señuelo y f) recuperar las partículas de fago unidas a la proteína diana.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que
a) el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab’, o F (ab’) 2 o un derivado de los mismos; o b) el anticuerpo se une al epítopo TF8-5G9 sobre el factor tisular murino.
FIG. 6A
MARCO MARCO MARCO MARCO ESTRUCTURAL ESTRUCTURAL ESTRUCTURAL ESTRUCTURAL LATERAL TOTAL LATERAL TOTAL 1 HIS1 0, 46 0, 58 31 ASP31 0, 28 0, 18 2 LYS2 0, 42 0, 36 32 ILE32 0, 01 0, 06 3 CYS3 0, 54 0, 67 33 PHE33 0, 08 0, 21 4 ASP4 0, 53 0, 41 34 ALA34 0, 25 0, 42 5 ILE5 0, 95 0, 76 35 ALA35 0, 19 0, 32 6 THR6 0, 23 0, 17 36 SER36 0, 98 0, 86 7 LEU7 0, 04 0, 03 37 LYS37 0, 76 0, 78 8 GLN8 0, 57 0, 42 38 ASN38 0, 83 0, 65 9 GLU9 0, 72 0, 50 49 THR39 0, 19 0, 42 10 ILE10 0, 00 0, 00 40 THR40 0, 59 0, 51 11 ILE11 0, 09 0, 07 41 GLU41 0, 39 0, 34 12 LYS12 0, 49 0, 39 42 LYS42 0, 80 0, 60 13 THR13 0, 00 0, 00 43 GLU43 0, 52 0, 36 14 LEU14 0, 00 0, 00 44 THR44 0, 38 0, 28 15 ASN15 0, 64 0, 46 45 PHE45 0, 04 0, 03 16 SER16 0, 51 0, 39 46 CYS46 0, 00 0, 00 17 LEU17 0, 01 0, 04 47 ARG47 0, 06 0, 04 18 THR18 0, 11 0, 29 48 ALA48 0, 02 0, 01 19 GLU19 1, 16 0, 97 49 ALA49 0, 00 0, 00 20 GLN20 0, 11 0, 13 50 THR50 0, 21 0, 17 21 LYS21 0, 56 0, 50 51 VAL51 0, 02 0, 03 22 THR22 0, 01 0, 10 52 LEU52 0, 00 0, 00 23 LEU23 0, 55 0, 53 53 ARG53 0, 65 0, 52 24 CYS24 0, 01 0, 00 54 GLN54 0, 60 0, 47 25 THR25 0, 07 0, 05 55 PHE55 0, 02 0, 04 26 GLU26 0, 89 0, 72 56 TYR56 0, 07 0, 06 27 LEU27 0, 20 0, 16 57 SER57 0, 51 0, 57 28 THR28 0, 48 0, 48 58 HIS58 0, 80 0, 73 29 VAL29 0, 01 0, 03 59 HIS59 0, 17 0, 13 30 THR30 0, 24 0, 19 60 GLU60 0, 59 0, 41 MARCO ESTRUCTURAL LATERAL Fig. 6B MARCO ESTRUCTURAL TOTAL 93 LEU93 94 ALA94 0, 02 0, 00 0, 04 0, 03 61 LYS61 0, 85 0, 78 62 ASP62 0, 19 0, 16 63 THR63 1, 02 0, 87 64 ARG64 0, 69 0, 62 65 CYS65 0, 01 0, 00 66 LEU66 0, 41 0, 30 67 GLY67 - 0, 30 68 ALA68 0, 84 0, 87 69 THR69 0, 59 0, 50 70 ALA70 1, 08 0, 77 71 GLN71 0, 77 0, 63 72 GLN72 0, 27 0, 20 73 PHE73 0, 59 0, 46 74 HIS74 0, 77 0, 59 75 ARG75 0, 27 0, 22 76 HIS76 0, 02 0, 02 77 LYS77 0, 65 0, 51 78 GLN78 0, 42 0, 33 79 LEU79 0, 03 0, 02 80 ILE80 0, 09 0, 07 81 ARG81 0, 71 0, 59 82 PHE82 0, 30 0, 23 83 LEU83 0, 00 0, 00 84 LYS84 0, 47 0, 39 85 ARG85 0, 59 0, 47 86 LEU86 0, 00 0, 00 87 ASP87 0, 04 0, 03 88 ARG88 0, 58 0, 54 89 ASN89 0, 15 0, 13 90 LEU90 0, 00 0, 00 91 TRP91 0, 26 0, 23 92 GLY92 - 0, 56 MARCO ESTRUCTURAL LATERAL MARCO ESTRUCTURAL TOTAL 129 SER129 0, 87 1, 20 95 GLY95 - 0, 81 96 LEU96 0, 34 0, 26 97 ASN97 0, 87 0, 85 98 SER98 0, 75 0, 52 99 CYS99 0, 03 0, 32 100 PRO100 0, 47 0, 43 101 VAL101 0, 12 0, 29 102 LYS102 0, 63 0, 67 103 GLU103 0, 23 0, 26 104 ALA104 1, 04 0, 84 105 ASN105 0, 69 0, 56 106 GLN106 0, 47 0, 45 107 SER107 0, 21 0, 16 108 THR108 0, 30 0, 24 109 LEU109 0, 00 0, 00 110 GLU110 0, 48 0, 39 111 ASN111 0, 66 0, 49 112 PHE112 0, 00 0, 01 113 LEU113 0, 04 0, 03 114 GLU114 0, 78 0, 56 115 ARG115 0, 53 0, 43 116 LEU116 0, 02 0, 02 117 LYS117 0, 49 0, 38 118 THRU 8 0, 74 0, 59 119 ILE119 0, 36 0, 29 120 MET120 0, 00 0, 00 121 ARG121 0, 53 0, 44 122 GLU122 0, 85 0, 62 123 LYS123 0, 18 0, 14 124 TYR124 0, 51 0, 41 125 SER125 0, 71 0, 47 126 LYS126 0, 65 0, 68 127 CYS127 0, 13 0, 35 128 SER128 0, 57 0, 68 FIG. 7A. MARCO ESTRUCTURAL LATERAL AREA- MARCO ESTRUCTURAL MARCO ESTRUCTURAL LATERAL ÁREA- MARCO ESTRUCTURAL 1 0, 51 0, 69 31 0, 21 0, 17 PRO1 TRP31 2 0, 12 0, 45 32 0, 53 0, 44 PRO2 SER32 3 0, 73 0, 50 33 ILE33 0, 44 0, 47 SER3 4 1, 11 0, 93 34 0, 30 0, 36 THR4 ASN34 5 0, 39 0, 30 35 0, 23 0, 21 ALA5 LEU35 6 0, 06 0, 07 36 0, 72 0, 78 LEU6 THR36 7 0, 79 0, 66 37 1, 07 0, 91 ARG7 ALA37 8 0, 76 0, 54 38 - 0, 32 GLU8 GLY38 9 0, 03 0, 02 39 0, 71 0, 57 LEU9 MET39 10 0, 20 0, 15 40 0, 40 0, 38 ILE10 TYR40 11 0, 84 0, 72 41 0, 54 0, 41 GLU11 CYS41 12 0, 33 0, 32 42 0, 41 0, 22 GLU12 ALA42 13 0, 00 0, 03 43 0, 23 0, 14 LEU13 ALA43 14 0, 28 0, 19 44 0, 07 0, 05 VAL14 LEU44 15 0, 73 0, 53 45 0, 14 0, 10 ASN15 GLU45 16 0, 16 0, 14 46 0, 15 0, 09 ILE16 SER46 17 0, 00 0, 03 47 0, 03 0, 02 THR17 LEU47 18 0, 64 0, 60 48 ILE48 0, 08 0, 06 GLN18 19 0, 88 0, 73 49 0, 34 0, 24 ASN19 ASN49 20 0, 60 0, 60 50 0, 06 0, 05 GLN20 VAL50 21 0, 75 0, 60 51SER51 0, 00 0, 00 LYS21 22 0, 98 0, 75 52 - 0, 00 ALA22 6LY52 23 0, 21 0, 17 53 0, 34 0, 33 PR023 CYS53 24 0, 32 0, 23 54 0, 24 0, 54 LEU24 SER54 25 0, 70 0, 49 55 0, 51 0, 50 CYS25 ALA55 26 0, 69 0, 50 56 ILE56 0, 03 0, 12 ASN26 27 - 0, 27 57 1, 29 1, 10 GLY27 GLU57 28 0, 12 0, 12 58 0, 62 0, 47 SER28 LYS58 29 0, 31 0, 24 59 0, 41 0, 41 MET29 THR59 30 0, 21 0, 14 60 0, 91 0, 77 VAL30 GLN60 FIG. 7B FIG. 7B. MARCO ESTRUCTURAL LATERAL ÁREA MARCO ESTRUCTURAL 61 ARG61 0, 61 0, 50 62 MET62 0, 08 0, 13 63 LEU63 0, 00 0, 00 64 SER64 0, 13 0, 16 65 GLY65 - 0, 53 66 PHE66 0, 04 0, 04 67 CYS67 0, 16 0, 17 68 PRO68 0, 76 0, 66 69 HIS69 0, 01 0, 01 70 LYS70 0, 25 0, 25 71 VAL71 0, 82 0, 72 72 SER72 0, 04 0, 03 73 ALA73 0, 02 0, 01 74 GLY74 - 0, 40 75 GLN75 0, 67 0, 75 76 PHE76 0, 34 0, 35 77 SER77 0, 00 0, 01 78 SER78 0, 73 0, 74 79 LEU79 0, 82 0, 78 80 HIS80 0, 85 0, 65 81 VAL81 0, 46 0, 43 82 ARG82 0, 39 0, 33 83 ASP83 0, 95 0, 69 84 THR84 0, 29 0, 36
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